上一期講到的原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)，本期將分享貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、凍存等操作步驟和技術(shù)要點(diǎn)，為您的細(xì)胞“健康成長(zhǎng)”保駕護(hù)航。根據(jù)細(xì)胞在瓶、皿等容器中，是否能貼附在支持物上生長(zhǎng)的特性，可分為懸浮型和貼附型兩大類。活體體內(nèi)的細(xì)胞離體后在體外培養(yǎng)大多數(shù)以貼壁的方式生長(zhǎng)，主要包括一些正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，比如成纖維細(xì)胞，骨骼組織（骨及軟骨），心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)分泌細(xì)胞，黑色素細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等。貼壁細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，形態(tài)上表現(xiàn)單一化而失去體內(nèi)原有的某些特征，多呈上皮樣或成纖維細(xì)胞樣。少數(shù)離體細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)則是懸浮生長(zhǎng)，主要包括一些取自血、脾臟或骨髓等的細(xì)胞。

復(fù)蘇篇凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。一般采用快速融化原則復(fù)蘇細(xì)胞，以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。操作步驟：

1. 從液氮罐或-80℃冰箱中取出凍存管，放入37℃水浴鍋中解凍，并不時(shí)搖動(dòng)（注意管口處高于水面，以免水進(jìn)入導(dǎo)致污染），整個(gè)過程最好在1min以內(nèi)；

2. 將凍存細(xì)胞加入到含有5-10ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，上下吹打數(shù)次，使凍存液與完全培養(yǎng)基充分混勻（若細(xì)胞對(duì)凍存劑(DMSO或甘油)敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中）；

3. 800-1000 rpm離心2-3min；

4. 棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)；

5. 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，接種濃度10^6 /ml，置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，定時(shí)觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況（貼壁細(xì)胞復(fù)蘇24h，若密度達(dá)到80%，則正常傳代；若密度不到80%則繼續(xù)培養(yǎng)到48小時(shí)再換液；懸浮細(xì)胞復(fù)蘇3天內(nèi)不建議離心換液。）。

細(xì)胞復(fù)蘇操作示意圖

傳代篇

一、 貼壁細(xì)胞傳代操作步驟

1. 用移液管或者巴氏吸管吸取培養(yǎng)液；

2. 使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細(xì)胞1-2次；

3. 棄PBS，加入胰蛋白酶-EDTA消化液（消化液濃度根據(jù)各細(xì)胞不同有調(diào)整），輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使胰酶與細(xì)胞表面充分接觸，37 ℃孵育2-3 min，加入含血清完全培養(yǎng)基終止消化。

4. 將細(xì)胞懸液移入離心管中，800 rpm-1000rpm離心5min，棄上清，加入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕吸打混勻，吹打過程中盡量不要出現(xiàn)氣泡。

5. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞量選擇合適的傳代比例，最后轉(zhuǎn)移置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

   二、 懸浮細(xì)胞傳代操作步驟

懸浮細(xì)胞由于本身在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中懸浮，無需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離，整個(gè)過程較為迅速，對(duì)細(xì)胞損傷較小。懸浮細(xì)胞傳代，通常有兩種方法，直接傳代法和離心傳代法。

（1）直接傳代法

①　懸浮細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%-90%左右（細(xì)胞懸液變黃，最大細(xì)胞密度隨細(xì)胞系不同而有所差異），即可傳代；

②　用吸管吸棄細(xì)胞懸液1/2～2/3；

③　加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

（2）離心傳代法

①　將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)；

②　800 rpm-1000rpm離心5min，棄上清；

③　使用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

④　吸管吸取適量細(xì)胞懸液，裝入新的培養(yǎng)瓶，再加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)比較

凍存篇

細(xì)胞凍存是指將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，以達(dá)到減少細(xì)胞代謝的作用，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存進(jìn)行保種的目的，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)或臨床使用。細(xì)胞凍存一般采用慢凍原則，慢凍可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞不會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)生大的冰晶而收到損害。

一、原理

• 當(dāng)溫度低至-70℃時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)及酶活性幾乎全部停止，低于-130℃時(shí)，細(xì)胞能達(dá)到最佳存活率。液氮可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的長(zhǎng)期保存。

• 冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜（DMSO）能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，延緩凍存過程，同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。

二、貼壁細(xì)胞凍存操作步驟

1. 預(yù)熱凍存液；

2. 用PBS沖洗細(xì)胞，加入胰酶消化（此步驟同細(xì)胞傳代操作）；

3. 終止消化后，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至無菌EP管，1000rpm離心5min；

4. 棄上清，加入預(yù)熱的細(xì)胞凍存液，細(xì)胞凍存最佳密度為5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；

5. 分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標(biāo)記；

6. 將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；

7. 將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。

三、懸浮細(xì)胞凍存操作步驟

1. 用移液管將細(xì)胞懸液吹吸均勻，將細(xì)胞懸液移入離心管；

2. 1000rpm離心 3 min，收集細(xì)胞沉淀；

3. 用預(yù)熱的凍存液重懸細(xì)胞，細(xì)胞凍存最佳密度為3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；

4. ?分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標(biāo)記；

5. 將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；

6. 將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。

貼壁細(xì)胞凍存操作示意圖

注意事項(xiàng)

①　細(xì)胞培養(yǎng)、傳代以及凍存需要嚴(yán)格的無菌操作。

②　傳代時(shí)需要適度的消化，消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

③　傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行。

④　細(xì)胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細(xì)胞懸液中。

⑤　應(yīng)選擇匯合度80%-90%左右，并且活力達(dá)90%以上處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行凍存操作，確保細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整。

⑥　程序凍存盒、細(xì)胞凍存液、完全培養(yǎng)基等試劑都要復(fù)溫至室溫備用。

⑦　凍存前注意切勿消化時(shí)間過長(zhǎng)、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng)，以免造成細(xì)胞損傷。

⑧　凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復(fù)蘇時(shí)水會(huì)滲入造成污染。

⑨　細(xì)胞不可長(zhǎng)期保存在-80℃冰箱中，放置時(shí)間不要超過3天。

⑩　液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。

以上是小恒為大家總結(jié)的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)步驟及要點(diǎn)，希望能給大家提供幫助。

最近收到不少小伙伴的反饋：THP-1和RAW264.7細(xì)胞不好養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)了各種問題，下游實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不下去了。下面小恒總結(jié)了一份THP-1和RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的攻略，希望能夠幫助大家攻克THP-1和RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的疑難雜癥。

THP-1細(xì)胞

1.THP-1細(xì)胞基本信息

THP-1細(xì)胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系，又名人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，懸浮圓形生長(zhǎng)。它來源于一位急性單核細(xì)胞白血病患者的血液，是人外周血的單核細(xì)胞系，可受PMA、TPA誘導(dǎo)向單核系方向分化，是各領(lǐng)域研究常用的細(xì)胞系之一。

培養(yǎng)條件：1640+10%FBS+0.05mM β-mercaptoethanol+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境：空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

凍存條件：50%RPMI-1640+40%FBS+10%DMSO

凍存細(xì)胞密度：2×10^6-3×10^6/ml為宜

傳代比例：1:3-1:6，每2-3天換液一次

THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)圖

2.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

①　偏好酸性環(huán)境：在偏酸性環(huán)境中，THP-1生長(zhǎng)更快，當(dāng)培養(yǎng)基稍微變黃（呈橘紅色）時(shí)，是適合細(xì)胞生長(zhǎng)的，此時(shí)補(bǔ)液或半換液即可。開啟后的RPMI 1640培養(yǎng)基，建議一周內(nèi)使用完畢。

②　密度依賴性：密度低時(shí)，生長(zhǎng)較慢，培養(yǎng)密度維持在4×10^5-8×10^5/ml為宜；超過1×10^6/ml則需要傳代。

③　THP-1細(xì)胞懸浮圓形生長(zhǎng)，偶有小聚團(tuán)，屬于正?，F(xiàn)象，無需吹散。當(dāng)貼壁細(xì)胞比例高于20%，說明細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境有異常，這時(shí)候就需要排查培養(yǎng)箱溫度及CO2濃度、培養(yǎng)基成分，以及培養(yǎng)器皿是否異常。

④　THP-1復(fù)蘇后恢復(fù)較慢，需要3-5天恢復(fù)狀態(tài)；其生長(zhǎng)需要穩(wěn)定環(huán)境，不頻繁拿出培養(yǎng)箱，不頻繁離心，如無特殊情況，復(fù)蘇后48小時(shí)內(nèi)不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作。

⑤　THP-1細(xì)胞對(duì)機(jī)械力較敏感。正常培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)盡量避免吹打力道過大。暴力吹打會(huì)使細(xì)胞分化和死細(xì)胞增加。

⑥　培養(yǎng)時(shí)瓶子豎立放置（瓶蓋朝上），可增加細(xì)胞局部密度，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

⑦　β-巰基乙醇可以消除活性氧自由基，維持細(xì)胞高密度生長(zhǎng)。若培養(yǎng)基中不添加β-巰基乙醇，長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)大量貼壁，嚴(yán)重聚團(tuán)等情況。當(dāng)細(xì)胞密度過大但需要維持時(shí)，可適當(dāng)增加巰基乙醇的比例（不超過標(biāo)準(zhǔn)量的1.5倍）。

⑧　對(duì)血清要求高，血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞狀態(tài)變化，建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。

RAW264.7細(xì)胞

1. RAW264.7細(xì)胞基本信息

RAW264.7又名小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系，為圓形或橢圓形，小而透亮，貼壁牢固。來源于雄性Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤，是常用的炎癥細(xì)胞模型之一，常見于研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫、分子免疫學(xué)。

RAW264.7細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬能力，在吞噬抗原后，細(xì)胞會(huì)釋放出趨化因子，促使分化，細(xì)胞伸出偽足，攀爬能力增強(qiáng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)條件惡劣或傳代后細(xì)胞稀疏等情況，都會(huì)使細(xì)胞呈現(xiàn)出梭形、長(zhǎng)梭形的形態(tài)，消化難度增加。

培養(yǎng)條件：DMEM+10%FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境：空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

凍存條件：55% DMEM+40% FBS+5% DMSO

傳代比例：1:2-1:4傳代，每1-2天換液一次

RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)圖

2.RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

①　RAW 264.7分裂活躍，培養(yǎng)時(shí)注意觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞由圓形或橢圓形變?yōu)樗慕切危蛏斐鰝巫愕惹闆r時(shí)，說明細(xì)胞狀態(tài)改變，需及時(shí)傳代。

②　細(xì)胞傳代時(shí)不需要用胰酶消化。采用細(xì)胞刮傳代或吹打傳代，刮下來的細(xì)胞，收集離心后重懸接種到新的培養(yǎng)瓶中（當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%的時(shí)候，最容易吹下）。

③　培養(yǎng)時(shí)，無法保證100% 不分化，若需控制細(xì)胞的分化，RAW264.7使用吹打傳代，能更好地控制細(xì)胞分化率。

④　吹打時(shí)力度一定要輕，切勿暴力吹打，只需接種比較容易吹打下來的圓形細(xì)胞，不需要強(qiáng)制性全部吹下來，梭形細(xì)胞或分化細(xì)胞貼壁較牢可直接舍棄。

⑤　RAW264.7對(duì)空間十分敏感，復(fù)蘇密度太高，細(xì)胞增殖太快，加劇細(xì)胞營養(yǎng)缺失，加速細(xì)胞老化。

⑥　脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較低，建議用慢病毒感染