研究思路

研究內(nèi)容

1. 研究材料

144 個腫瘤樣本、46 個近腫瘤樣本和來自四個縮小乳房成形術(shù)的組織的 2600 萬個細胞

2.研究方法

• 組織準(zhǔn)備：手術(shù)切除后，新鮮組織樣本立即轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 MACS 組織儲存溶液

• 抗體和抗體標(biāo)記

• 抗體染色和細胞體積定量

• 免疫熒光成像

• 量化和統(tǒng)計分析

  
  

研究結(jié)果

1.乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)的單細胞蛋白質(zhì)組圖譜

研究者對 144 個腫瘤樣本進行了大規(guī)模單細胞蛋白質(zhì)組分析，包括54 個luminal A，71個luminal B，6個 luminal B-HER2，1個HER2，和6個TN 腫瘤。組織病理學(xué)將樣本分為 106 個浸潤性導(dǎo)管、15 個浸潤性小葉和 19 個混合或其他腫瘤。使用自動化系統(tǒng)從所有組織樣本中生成單細胞懸浮液，添加標(biāo)簽后用于抗體染色，并同時通過質(zhì)譜流式細胞儀進行分析（圖 1 A 和S1 A）。分析產(chǎn)生了2600 萬個單細胞圖譜，每個樣本平均有 84.7% 的活細胞、非凋亡細胞（圖 S1B 和 S1C)。

為了確保高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，研究者確認了跨條形碼板的重復(fù)樣本的標(biāo)記表達以及跨抗體組的活細胞和免疫細胞頻率的相似性（圖 S1 D 和 S1E）。

圖S1?| 乳腺癌單細胞圖譜的細胞類型鑒定

為了可視化腫瘤和非腫瘤細胞的多樣性，作者使用降維算法 t 分布隨機鄰域嵌入生成了二維圖。大多數(shù)細胞是上皮細胞或免疫細胞，內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的豐度較低（圖 1B）。額外的成纖維細胞亞群和脂肪細胞可能在被描述為“其他”的細胞中（圖1C）。為了比較腫瘤和非腫瘤組織之間的細胞類型頻率，作者應(yīng)用 PhenoGraph 算法，將數(shù)據(jù)劃分為 42 個簇（圖 S1 M 和 S1N）。與非腫瘤組織相比，乳腺腫瘤富含上皮細胞，并且含有更少的內(nèi)皮細胞和成纖維細胞（圖1D）。FAP+SMA+成纖維細胞在腫瘤中比在近腫瘤組織中更豐富（圖 S1 O 和 S1P）。細胞類型頻率在腫瘤亞型之間和之間有所不同，在 TN 和 HER2 +樣本中觀察到的免疫細胞頻率高于其他乳腺癌類型（圖 1 E 和S1 P）。

2.乳腺癌的免疫狀況

T細胞和髓細胞是我們研究中最豐富的免疫細胞類型；較少檢測到自然殺傷細胞(NK)、B細胞、粒細胞、漿細胞、嗜堿性細胞和漿細胞樣樹突狀細胞(圖2A和S2A S2D)。乳腺腫瘤富含T細胞和B細胞，與腫瘤旁組織相比，含有較低頻率的NK細胞和粒細胞(圖2A)。如前所述，腫瘤相關(guān)免疫細胞頻率在患者間存在顯著差異(圖2A) 。

圖2 | 乳腺癌的免疫狀況

T 細胞和巨噬細胞可以發(fā)揮促腫瘤或抗腫瘤活性，通過 t-SNE 和 PhenoGraph 對 T 細胞的深入分析確定了十個 CD4和十個 CD8 T 細胞簇（T01-T20；圖 2 B-2D）。大多數(shù) T 細胞簇具有效應(yīng)記憶表型（CD197low, CD45RAlow），腫瘤相關(guān) T 細胞作為表型連續(xù)體存在于 CD4和 CD8譜系中（圖 2 D 和S2 E）。CD4 ?T 細胞中 PD-1 的平均表達水平高于CD8 ?T 細胞（圖 2 F）。PD-1 的平均表達水平和 PD-1 ?T 細胞頻率在 CD4 和 CD8 +隔室中相關(guān)，支持這些細胞由 T 細胞擴增產(chǎn)生的假設(shè)。

此外，研究者觀察到 ER 和 ER腫瘤的 T 細胞狀況的差異，包括 ER疾病中更高頻率的 T-regs （圖2H）。在超過一半的 ER腫瘤但只有 12% 的 ER 腫瘤中，超過 10% 的 T 細胞表達 PD-1（圖 S2 G）。不同的 PD-1表型分別富集：PD-1highCTLA-4 ?CD38 T 細胞在 ER腫瘤中更常見，而 PD-1?CTLA-4 - CD38 - T 細胞（T14）在 ER +腫瘤中富集（圖2H）。然而，許多 ER腫瘤確實顯示 PD-1高CTLA-4 ?CD38 T 細胞和 T-reg 的頻率與 ER 腫瘤相當(dāng)或更高（圖2H）。

圖S2?| 乳腺腫瘤和非腫瘤組織中的免疫細胞表型分析

ER 腫瘤可根據(jù)低增殖和高增殖分別分為luminal A和luminal B。超過 10% 的 T 細胞在 18% 的 luminal B 腫瘤中表達 PD-1，但只有 7% 的 luminal A 腫瘤（圖 S2 H）。PD-1 int CTLA-4 - CD38 - T 細胞 (T07) 在 luminal A 疾病中更常見，而 T-regs 在 luminal B 腫瘤中富集（圖 2 I）。作者還在不同級別的腫瘤中觀察到不同的 T 細胞景觀。在 28% 的 3 級腫瘤、9% 的 2 級腫瘤和 10% 的 1 級腫瘤中， PD-1 T 細胞占 T 細胞的 10% 以上（圖 S2 I）。3級腫瘤具有更多的PD-1高CTLA-4 CD38 T 細胞（T09 和 T11）和更少的 PD-1 int CTLA-4 CD38 T 細胞（T07 和 T14）比低級別腫瘤（圖 S2 J）。這表明免疫抑制的 T 細胞景觀與預(yù)后不良的腫瘤有關(guān)，包括 ER、高增殖和高級別腫瘤，但也在一部分 ER 腫瘤中觀察到。

3.乳腺腫瘤富含免疫抑制性巨噬細胞表型

為了表征TAM群體，將 t-SNE 和 PhenoGraph 應(yīng)用于所有骨髓細胞（圖 2 J 和S2 D），產(chǎn)生五類 19 個骨髓簇（M01-M19）。與近腫瘤組織相比，腫瘤富含 TAM，缺乏組織駐留巨噬細胞（M08 和 M09）、經(jīng)典循環(huán)（M06）和促炎（M15）單核細胞（圖2M）。TAM 的浸潤與侵襲性疾病有關(guān)。

與 ER腫瘤相比， ER腫瘤包含更高頻率的 M01 和 M17 PD-L1 TAM，具有 M04、M05、M10 或 M12 表型的骨髓細胞更少（圖 2 N）。一部分 ER +腫瘤具有 M01 和 M02 PD-L1 TAM，其頻率與 ER腫瘤相當(dāng)或更高（圖 2 N 和S2 L）。與 Luminal A 腫瘤相比，Luminal B 腫瘤含有更多具有 M07 或 M17 表型的髓細胞，較少具有 M04 表型，以及更多的 PD-L1 ?TAM。圖 2 O 和S2 M)。與 2 級腫瘤相比，PD-L1 ?TAM 在 3 級腫瘤中富集（圖 S2 N）。與低級別腫瘤相比，3 級腫瘤包含更少的具有 M04 或 M05 表型的細胞，但更多的經(jīng)典單核細胞 (M06)（圖 S2 O）。

4.腫瘤上皮細胞異質(zhì)性和表型異常

對來自腫瘤和非腫瘤組織的上皮細胞的分析（STAR 方法）揭示了上皮標(biāo)志物的雙峰和梯度樣表達，表明許多不同的細胞表型（圖3A和3B ）。在 PhenoGraph 中實施的共識聚類方法（圖 S3 A；STAR 方法）揭示了 45 個上皮細胞簇（Ep01-Ep45）。層次聚類根據(jù)標(biāo)記表達將它們分為七個管腔組 L1-L7 和兩個基礎(chǔ)組 B1 和 B2（圖 3 C、S3 B 和 S3C）。

圖3?| 乳腺癌腫瘤細胞表型研究

研究者根據(jù)譜系標(biāo)記表達模式鑒定了乳房成形術(shù)和近腫瘤組織中的管腔和肌上皮細胞（圖 3 C、3D 和S3 D）。乳腺上皮細胞系證實了這些模式的可靠性（圖 3 E）。鑒定了增殖的 (Ki-67 ?) 非腫瘤管腔細胞 (圖 S3 E)。大約 55% 的腫瘤衍生細胞是 L1 和 L2 組的成員，這表明腫瘤樣本中富含分化的正常樣管腔細胞。L3-L7 組以腫瘤細胞為主（圖 3C）。L3 組表型顯示高水平的 EpCAM 和 CD49f 和低 ERα 表達（圖 3 C 和S3 D-S3F），這是腔內(nèi)祖細胞的特征。L4 組表型顯示出高水平的激素受體ERα、孕酮受體 B (PRB) 和AR，以及受體酪氨酸激酶HER2、EGFR和肝細胞生長因子受體(c-MET)（圖 3 C 和S3 F）。這些受體與 ERα 或 HER2 的共表達可以賦予抗 ERα 和抗 HER2 治療的抗性。缺乏 ERα 和 HER2 與抗 ERα 和抗 HER2 治療的抗性有關(guān)。Ki-67 ?luminal 腫瘤細胞在所有 luminal 簇組中均發(fā)現(xiàn)，并且在 L7 組中最常見（圖 S3 G）。

圖S3 | 乳腺腫瘤細胞表型的深入分析

此外，L1-L7 組表型在腫瘤亞型中的分布不同。與 HER2 +和 TN 腫瘤相比，L1 組和 L2 組表型指示成熟的管腔細胞和 L4 組和 L5 組強烈表達 ERα 的表型在管腔 A 和 B 腫瘤中更常見（圖3F）。增殖組 L7 表型常見于幾個 luminal B 腫瘤、幾個 luminal A 腫瘤和一個 TN 腫瘤。Luminal B-HER2 和 HER2 腫瘤含有來自 L3 和 L6 組的細胞（圖3F）。與鄰近的非腫瘤組織相比，許多管腔腫瘤含有更少的 K7 和更多的 K8和 K18細胞（圖 S3H)，表明可能由上調(diào)的PI3K和 AKT 信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)的細胞角蛋白轉(zhuǎn)換。

5.表型異常和腫瘤個體性與預(yù)后不良的特征

隨后，建立了三個計算分數(shù)來量化腫瘤異質(zhì)性的不同方面（圖 4A）。表型異常描述了腫瘤細胞表型偏離非腫瘤上皮細胞的程度。腫瘤個體性根據(jù)細胞表型量化腫瘤的相似性。腫瘤豐富度表示生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)不同共存腫瘤細胞表型的數(shù)量。

圖4?| 分子表型異常和腫瘤個體性與預(yù)后不良的特征

為了描述異常表型，利用自動編碼器識別非腫瘤上皮細胞表型并計算每個腫瘤細胞的均方誤差 (MSE)（圖 S4 A）。結(jié)果顯示，在上皮簇組 L6、L7、B1 和 B2 中檢測到最異常的腫瘤細胞（圖4B）。與富含來自 L1 和 L2 組細胞的腫瘤相比，主要包含來自這些簇的細胞的腫瘤更多地偏離近腫瘤組織（圖 4 C-4E）。表型異常細胞在高級別腫瘤、大多數(shù) ER 腫瘤、一部分 ER腫瘤和預(yù)后不良的亞型腫瘤中富集（圖 4F-4H)。表型異常與缺氧和增殖標(biāo)志物表達相關(guān)（圖 4 I），反映了腫瘤生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的異常生長條件。與 4% 的 CA9腫瘤細胞相比，約 25% 的 CA9腫瘤細胞表現(xiàn)出 EMT 表型。隊列中的一些近腫瘤組織樣本包含表型異常細胞和高頻率的 CA9或 Ki-67細胞（圖 S4 B 和 S4C；表 S5 ），可能代表原位癌前病變導(dǎo)管癌的區(qū)域。

圖S4 | 腫瘤和非腫瘤組織樣本的表型異常和個體性

為了評估腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的個體性，對所有樣本的上皮細胞數(shù)據(jù)應(yīng)用了基于圖表的方法（圖 4 A）。個體性得分表明樣本的細胞是否更類似于同一樣本的細胞或其他樣本的細胞（圖 S4 D）。腫瘤顯示出比近腫瘤組織更高的個體評分（圖 4 J）。重要的是，腫瘤個體性與表型異常相關(guān)（圖4K），這表明腫瘤細胞與非腫瘤細胞的表型偏離越多，它們在不同患者的腫瘤中發(fā)現(xiàn)的可能性就越?。▓D S4D)。腫瘤個體性在高級別腫瘤和 luminal B、luminal B-HER2或 TN 亞型腫瘤中更為突出（圖 S4 E）。ER 腫瘤的個體差異很大，并且與 ERα 細胞的百分比相關(guān)（圖 4 L 和 4M）。未檢測到個體與侵襲淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)（圖S4 F）。

為了探索腫瘤豐富度（圖 4A），計算了每個樣本的每個上皮細胞簇的頻率，并報告了 1% 以上的簇數(shù)。所有腫瘤和非腫瘤樣本都包含來自多個簇的細胞（圖 4 N）。值得注意的是，與非腫瘤組織相比，大多數(shù)腫瘤的豐富度沒有增加，并且腫瘤豐富度與個體性反相關(guān)（圖4O 和 4P）。在 43% 的腫瘤樣本（144 個中的 62 個）中，至少 50% 的腫瘤所有細胞屬于一個簇，這可能反映了不同癌細胞克隆的擴增（圖 4N)。在 58% 的 3 級腫瘤、33% 的 2 級腫瘤和 35% 的 1 級腫瘤中觀察到這種集群優(yōu)勢。在 51% 的 luminal B、50% 的 luminal B-HER2和 67% 的 TN 腫瘤中觀察到簇優(yōu)勢，但在 luminal A 腫瘤中僅占 29%。在 45 個上皮細胞簇中，37 個簇（82%）占一個或多個腫瘤中所有細胞的至少 50%（圖 4 N）。七個優(yōu)勢簇是腫瘤特異性的，四個顯示出高表型異常（圖 4 B 和S4 G）。

對隊列中的 10 個腫瘤進行的分析，盡管新輔助化療并未顯著消退，但揭示了個體表型組成，表明不同的腫瘤細胞表型在治療中存活（圖 4 Q）。這些包括具有 ERα HER2表型和 ERα HER2表型的高度異常腫瘤細胞（圖 4B 和 4Q）。從其他四名患者那里收集了同一腫瘤的兩個不同區(qū)域。在三個案例中，在兩個區(qū)域都觀察到了相似的表型組成。在第四個腫瘤中，優(yōu)勢克隆存在于兩個區(qū)域，但頻率不同，一個區(qū)域的增殖特征（5% Ki-67）比另一個區(qū)域（0.6% Ki-67）更具增殖性（圖 S4 H）。

6.基于腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的分類揭示了不同的組和多個腫瘤單例

層次聚類生成的熱圖顯示三組包含許多腫瘤、四組包含三個或四個腫瘤、36 個腫瘤單例和三組非腫瘤樣本（圖 5）。主成分分析確定了解釋不同組之間最高變異性的集群。此外，Tu1-Tu7 組的臨床亞型和分級存在異質(zhì)性（圖 S5 A 和 S5B）。

圖5?| 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)系與疾病進展的特征

在 N2 組中發(fā)現(xiàn)了所有乳房成形術(shù)樣本和 54% 的近腫瘤樣本，表明生態(tài)系統(tǒng)密切相關(guān)（圖 5A）。與非腫瘤組織相似，在 N2 組中發(fā)現(xiàn)的五個腫瘤主要包含 L1 和 L2 組上皮表型、循環(huán) T 細胞 (T16) 和組織駐留巨噬細胞 (M08) (圖 5A )。所有 5 個腫瘤均為 luminal A 亞型和低級別，這表明腫瘤在表型上與非腫瘤組織相似，或者這些樣本中的腫瘤含量特別低。腫瘤單例通常不共享腫瘤細胞表型，反映了高腫瘤個體性，并且比 Tu1 和 Tu3 組的腫瘤具有更高的表型異常評分和更多的增殖細胞（圖 5 C-5E）。Luminal B-HER2 、HER2和 TN 腫瘤要么是小腫瘤組的一部分，要么是單個腫瘤（圖 5A）。因此，腫瘤上皮及其免疫環(huán)境中的模式都包含腫瘤分層信息。

7.乳腺腫瘤及其免疫環(huán)境是相互交織的實體，兩者對于分類都很重要

腫瘤細胞和腫瘤-宿主細胞相互作用的網(wǎng)絡(luò)推動著疾病進展，是藥物干預(yù)有希望的目標(biāo)。為了系統(tǒng)地闡明同型和異型腫瘤與免疫細胞的關(guān)系，對所有樣品中所有細胞表型簇的頻率進行了成對 Spearman 相關(guān)分析（圖 6A -6C；表 S5）。在來自不同簇組的表型之間發(fā)現(xiàn)了同型上皮細胞關(guān)系（圖6A）。非腫瘤管腔表型如 Ep30 和 Ep31（L1 組）是相關(guān)的，而腫瘤特異性表型通常分別富集，反映表型優(yōu)勢和腫瘤個體性（圖 6A ）。L1 和 L2 組以及 Ep39 簇中非腫瘤表型的頻率與這些免疫抑制表型呈負相關(guān)（圖6B ），但與 PD-1 ?CTLA-4 ?CD38 表型 T07 和 T18 相關(guān)（圖 6 B）。腫瘤相關(guān)免疫細胞之間的關(guān)系分析顯示，T-regs 和 PD-L1 ?TAM 表型與 PD-1高CTLA-4 CD38 的 T 細胞表型相關(guān)，表明免疫抑制相互作用（圖 6 C）。T-regs 和 PD-L1 TAM 沒有或僅與 PD-1 ?CTLA-4 CD38 T 細胞表型負相關(guān)（圖 6 C）。

此外，免疫抑制模式與腫瘤表型異常和個體評分、缺氧和增殖相關(guān)（圖6D）。免疫抑制性 TAM 和 T 細胞與 ERα 細胞豐度之間的相關(guān)性（圖 6 D），表明雌激素信號傳導(dǎo)是腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的塑造力量。

圖6?| 乳腺腫瘤及其免疫環(huán)境是相互交織的實體

圖S6?| 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中關(guān)系的深入分析

關(guān)系分析表明腫瘤免疫環(huán)境中有相當(dāng)大的結(jié)構(gòu)，不同亞型的腫瘤，包括 ER 和 ER腫瘤，在 TIG2 中分組，提出了 TIG2 中豐富的免疫細胞是否位于腫瘤生態(tài)系統(tǒng)近端的問題。因此，除了免疫抑制環(huán)境外，TIG2 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)還包含多個腫瘤細胞群，有可能逃避常見的癌癥治療。

相關(guān)討論

異質(zhì)腫瘤細胞、浸潤性 T 細胞和巨噬細胞之間的交流塑造了乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)，對疾病進展和臨床結(jié)果有影響。通過對來自 144 個腫瘤樣本、46 個近腫瘤樣本和來自四個縮小乳房成形術(shù)的組織的 2600 萬個細胞進行大規(guī)模細胞計數(shù)分析，構(gòu)建了一個廣泛的人類乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)單細胞圖譜。該圖譜揭示了乳腺上皮細胞和免疫細胞的巨大表型多樣性、腫瘤細胞的表型異常和腫瘤個體性，并突出了同型和異型腫瘤-免疫細胞關(guān)系，實現(xiàn)了基于生態(tài)系統(tǒng)的患者分類。乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)圖譜的建立為識別腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中臨床相關(guān)的細胞表型及其關(guān)系提供了基礎(chǔ)，為將來用于患者分層和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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