「青蓮聚焦」鐵死亡|腫瘤|脂質組學，是你想了解的三足鼎立嗎？
各位科研男孩/女孩們，好久不見！經(jīng)過前一周的專題分享，相信大家已經(jīng)對鐵死亡機制有了一定的了解，今天給大家分享一篇2021年發(fā)表在NATURE COMMUNICATIONS?（IF：14.919）期刊上題為“Dysregulated cholesterol homeostasis results in resistance to ferroptosis increasing tumorigenicity and metastasis in cancer”的文章，帶大家一起走進脂質代謝與鐵死亡的世界，探究膽固醇穩(wěn)態(tài)失調導致對鐵死亡的抵抗，增加腫瘤的致瘤性和轉移性。
??
研究背景
?肥胖、脂質穩(wěn)態(tài)失調和代謝綜合征的其他后遺癥與乳腺癌風險增加和已確診疾病患者的預后較差相關，高膽固醇血癥是絕經(jīng)后婦女患乳腺癌的獨立危險因素，了解高膽固醇血癥對疾病發(fā)病率和既定疾病的不同影響，將有助于開發(fā)新的方法來以獲得大的治療效益。??
研究思路
?一、27-羥基膽固醇抑制癌細胞的生長二、長期暴露于27HC的腫瘤細胞致瘤性和轉移性更強三、細胞內脂質積累增加是抗27HC的一個特征四、27HC抗性細胞不受鐵死亡的影響五、GPX4活性可預防鐵死亡并促進腫瘤轉移??
研究結果
?一、27-羥基膽固醇(27HC)通過其抑制膽固醇攝取/合成的能力來抑制癌細胞的生長?
單加氧酶CYP27A1從膽固醇中產(chǎn)生的27HC可以作為雌激素受體（ER）的部分激動劑發(fā)揮作用。作者假設27HC對ER的作用可能減弱其對膽固醇攝取/合成的抑制活性，并且在ER陰性細胞中，27HC的功能可能不同。在此假設基礎上，評估了27-羥基膽固醇(27HC)對雌激素受體(ER)陽性乳腺癌細胞(MCF7)生長的影響，發(fā)現(xiàn)在去除外源性類固醇的培養(yǎng)基(CFS)和全培養(yǎng)基(FBS)中，27HC分別促進和抑制細胞增殖與菌落形成。而在ER陰性細胞中，27HC抑制4T1、MDAMB436、Py230、MDAMB231和HCC1954乳腺癌細胞以及黑素瘤細胞模型的增殖、遷移和菌落形成。27HC對觀察到的ER陰性癌細胞生物學的影響可能歸因于它作為膽固醇合成/攝取的負調控因子通過對SREBP和LXR依賴的信號通路的作用。在所檢測的癌細胞中，27HC抑抑制固醇調控結合蛋白SREBP1c和SREBP2靶基因的表達，補充膽固醇可逆轉27HC的抗增殖活性及其抑制菌落形成的能力，表明27HC通過抑制膽固醇的攝取和合成減弱癌細胞
的生長。
?
二、體內評估：長期暴露于27HC的腫瘤細胞致瘤性和轉移性更強。
鑒于目前已建立的膽固醇升高（和27HC）與癌癥進展之間的聯(lián)系，作者認為，臨床觀察與27HC抑制細胞增殖的結果不一致，這可能與本研究中通過使細胞/腫瘤發(fā)生膽固醇/ 27HC急性升高而建立的高膽固醇血癥模型有關。為了探索這種可能性，構建ER陰性乳腺癌細胞的27HC抗性細胞系，發(fā)現(xiàn)敏感性存在顯著差異(27HCS vs 27HCR細胞)，但無27HC時敏感和抗性細胞的總體增殖能力相似。然而，異種移植在小鼠體內時，所有細胞模型的抗性細胞比敏感細胞更具致瘤性。尾靜脈注射模型評估敏感和抗性細胞肺轉移瘤的轉移能力結果顯示，在三種模型(4T1, Py230和BPD6)中，敏感和抗性細胞肺轉移瘤的轉移能力。綜上所述，細胞在適應27HC水平的增加時，27HC抗性細胞獲得了使它們更具致瘤性和轉移性的活性。
?
三、細胞內脂質積累增加是抗27HC的一個特征，與致瘤性有因果關系。
接下來評估了27HC耐藥性的生化機制，以及它們如何促進癌細胞的致瘤性和轉移能力的增加。首先探討了27HC降低膽固醇/脂質合成的機制可能在耐藥細胞中被破壞的可能性。采用BODIPY染色法評估脂質含量，發(fā)現(xiàn)27HCR細胞積累了大量的中性脂質，表明為了抵消27HC對膽固醇和脂類合成的抑制作用，27HCR細胞可能會增加其攝取中性脂類的能力。為了明確累積脂質的成分，該研究對培養(yǎng)于FBS(脂質豐富)和CFS(脂質貧乏)的HCC1954-27HCR和27HCS進行了脂質組學分析，結果發(fā)現(xiàn)增加脂質攝取是27HCR細胞的一個特征。在FBS培養(yǎng)條件下，27HCR的總脂質含量顯著高于27HCS。FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞的所有脂質豐度均提高，而在CFS培養(yǎng)基中生長的細胞則沒有增加(中性脂質除外)，表明脂質攝取增加是27HCR細胞的一個特征。27HCR細胞中的中性脂質增加與培養(yǎng)基的脂質含量無關，表明細胞在產(chǎn)生抗性時可能也具有增加脂質合成的能力。與27HCS細胞相比，27HCR細胞在FBS培養(yǎng)基中生長時膽固醇水平升高；在CFS培養(yǎng)基中，盡管總膽固醇含量增加，但細胞間膽固醇含量沒有差異。進一步分析敏感和抗性細胞的脂質譜發(fā)現(xiàn)，中性脂質在27HCR細胞中增長顯著，表明增加脂質攝取，并在較小程度上增加脂質生物合成，是細胞抵抗27HC抗增殖作用的一個特征。雖然脂質攝取增加和/或生物合成之間的關聯(lián)被確定為27HC耐藥性的標志，但這種活性與耐藥性的因果關系和是否有助于癌癥細胞生物學的改變尚不清楚。為了解決這個問題，進一步研究了4T1-、Py230-、HCC1954-、B16F10-和BPD6-27HCS和27HCR細胞在FBS和DL-FBS培養(yǎng)基中的敏感性/抗性，發(fā)現(xiàn)除BPD6細胞外，僅在脂質充足的條件下27HC才具有抗增殖活性，表明去脂質逆轉了27HCR細胞體外遷移能力的增強。為了確定27HCR細胞積累脂質能力增加的機制，評估了27HCR耐藥不同模型中主要脂質轉運蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)來源于小鼠(4T1和Py230)的27HCR細胞中Fabp4和Vldlrmrna表達顯著增加，而人源HCC1954細胞中的CD36表達增加。因此，盡管脂質攝取增加與抗性表型有關，但細胞可以利用不同的機制促進脂質攝取和積累。鑒于已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明CD36、VLDLR和FABP4的高表達與侵襲性癌癥和轉移表型相關。
四、27HC抗性細胞可防止鐵死亡
脂質代謝失調涉及癌細胞病理生物學的許多方面，細胞可以通過參與GPX4（谷胱甘肽-過氧化物酶4）依賴的抗氧化途徑=或下調負責脂質氧化的酶的表達來耐受脂質依賴性應激。因此，作者推斷在進化到27HC抗性狀態(tài)時，癌細胞可能會增加鐵死亡的誘導閾值。通過使用免疫印跡分析評估了GPX4在幾種細胞系(B16F10、Py230、HCC1954和MDAMB436)中的表達，發(fā)現(xiàn)GPX4在所有細胞中都有表達，并且當27HC濃度增加時其表達下調。這是一個重要但并非完全出乎意料的發(fā)現(xiàn)，因為甲羥戊酸是GPX4合成所需的一種非常特異的硒代半胱氨酸t(yī)RNA成熟所必需的。補充外源性甲羥戊酸后，27hC依賴的GPX4表達下調顯著減弱。為了解決在GPX4下調后，當細胞從27HC敏感狀態(tài)發(fā)展到耐藥狀態(tài)時，細胞如何能夠承受累積脂質的壓力這個問題，作者研究了敏感和耐藥細胞中的GPX4生物學，以及它是如何被27HC調節(jié)的。將erastin作為陽性對照納入研究（可以下調GPX4），觀察到27HC和erastin均抑制27HCS細胞中GPX4的表達，表明27HCR細胞失去了使27HC（和erastin）依賴的GPX4表達下調的調節(jié)機制。在Py230、HCC1954和MDAMB436-27HCR細胞中，觀察到與脂質過氧化增加相關的基因表達定量下調（Acsl4、Lpcat3和Pebp1）。表明27HCR細胞通過調節(jié)與脂質過氧化相關基因的表達降低GPX4通路的脅迫。除了GPX4途徑的改變外，NRF2調節(jié)的抗氧化防御機制和細胞鐵代謝的改變也會影響對鐵死亡的敏感性。作者推斷，如果GPX4的穩(wěn)定表達或活性與27HC抗性表型（鐵死亡）有因果關系。實驗觀察到B16F10、Py230、MDAMB436、HCC1954和4T1細胞對GPX4（RSL3和ML210）和Xc轉運體（erastin）的直接共價抑制劑的抵抗力都顯著增強?？傊?，在適應脂質誘導的代謝應激時，細胞可以通過穩(wěn)定GPX4的表達、增加GPX4依賴的抗氧化系統(tǒng)的活性或減少脂質過氧化物的產(chǎn)生來避免鐵死亡性細胞死亡。
?
五、GPX4活性可預防鐵死亡并促進轉移。?
將熒光素酶標記的Py230-27HCS和-27HCR細胞靜脈注射到裸鼠或C57/BL6小鼠體內。2個月后，Py230-27HCS細胞出現(xiàn)微轉移，而Py23027HCR細胞形成了大轉移。從這些轉移病灶中獲取細胞，并在體外評估其對鐵死亡誘導劑（RSL3和ML210）的敏感性，結果表明從27HCS或27HCR細胞形成的病變中分離出的轉移細胞對這些藥物具有同等的耐藥性。
抗鐵死亡是轉移細胞的一個特征，因此評估了在高轉移性B16F10模型和低轉移性Py230細胞中破壞GPX4表達對轉移形成的影響。在本研究中，使用基于shRNA的方法下調B16F10和Py230細胞中GPX4的表達，GPX4基因敲除略微降低B16F10細胞的增殖，但對體外培養(yǎng)的Py230細胞的生長影響極小。重要的是，觀察到GPX4的部分敲除逆轉了對上述GPX4抑制劑的耐藥性。向C57/BL6小鼠靜脈注射對照細胞（GPX4 shScramble對照）和兩個獨立的細胞系，在這些細胞系中，B16F10和Py230細胞的27HCS和27HCR衍生物中GPX4被敲除。敲除GPX4可以顯著降低B16F10-27HCS和27HCR的腫瘤轉移。同樣，敲低GPX4后Py230-27HCR細胞中腫瘤無轉移，表明GPX4在腫瘤轉移中可以預防鐵死亡。
?
??
總結：
?作者強調了鐵死亡在腫瘤生長和轉移中的普遍重要性，并表明血脂異常/高膽固醇血癥通過選擇抗鐵死亡細胞影響癌癥發(fā)病機制，細胞長期暴露于27-羥基膽固醇(27HC)，會選擇性使細胞表現(xiàn)出細胞攝取和/或脂質生物合成增加，從而表現(xiàn)出腫瘤發(fā)生和轉移的能力。重要的是，積累的脂質對細胞施加的代謝壓力使得GPX4持續(xù)表達，這是一種鐵死亡的負調節(jié)劑，GPX4敲除減輕了27HC抵抗細胞的腫瘤生成和轉移。?
