2022年11月9日，Nature?在線發(fā)表了北京大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤轉(zhuǎn)化研究中心張寧團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）張澤民團(tuán)隊(duì)、北京大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科朱繼業(yè)團(tuán)隊(duì)緊密合作的研究成果，綜合解析了肝癌的免疫微環(huán)境亞型和中性粒異質(zhì)性。該研究清晰界定了五種肝癌免疫微環(huán)境亞型，為肝癌生物標(biāo)志物探索提供了數(shù)據(jù)，明確表述了大部分腫瘤相關(guān)中性粒亞群的免疫抑制功能，為潛在免疫治療手段提供了線索。該研究中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Nature

【影響因子】69.504

【發(fā)表單位】北京大學(xué)

研究背景

原發(fā)性肝癌（PLC）分為三種組織學(xué)亞型：肝細(xì)胞癌（HCC）、肝內(nèi)膽管癌（ICC）和混合型肝細(xì)胞癌—膽管癌（CHC）。目前對于 PLC 的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）基線了解有限，界限不清晰，阻礙了肝癌患者生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。肝癌研究亟需對臨床信息充分的多種 PLC 亞型患者進(jìn)行單細(xì)胞研究來解析腫瘤中的全部細(xì)胞類型。另外，關(guān)于腫瘤中的中性粒細(xì)胞是促癌還是抑癌作用仍存在爭議，沒有研究對于腫瘤中的中性粒異質(zhì)性進(jìn)行全面解析。

研究思路

主要結(jié)論

1、大規(guī)模肝癌患者單細(xì)胞圖譜

研究對來自 124 例未治療的肝癌患者的 160 個(gè)樣本進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，包括 79 名 HC 例患者，25 例 ICC 患者和 7 例 CHC 患者（圖1a），共得到 1,092,172 個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)，分為 89 個(gè)細(xì)胞群（圖1b, c）。得益于大型隊(duì)列和非富集策略，數(shù)據(jù)得到了多種細(xì)胞類型和大量中性粒信息。數(shù)據(jù)中腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）細(xì)胞具有顯著的組織和腫瘤亞型特異性。拷貝數(shù)分析顯示大部分上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，并且具有患者異質(zhì)性。該圖譜數(shù)據(jù)還整合了隊(duì)列臨床信息和基因組信息，有利于肝癌細(xì)胞異質(zhì)性的綜合分析和細(xì)節(jié)研究。

2、揭示肝癌五種免疫微環(huán)境亞型（TIMELASER）

研究人員根據(jù)細(xì)胞群共富集模式將 TIME 細(xì)胞類型聚類成 5 個(gè)細(xì)胞群模塊（CM1-CM5）（圖2a）。根據(jù)這些模塊在隊(duì)列中的富集差異，結(jié)合細(xì)胞群、功能標(biāo)記基因表達(dá)、TIME 相關(guān)基因特征和預(yù)后相關(guān)性，將患者分成 5 種 TIME 亞型（圖2b, c）。

其中，CM1 包括活性髓系和 T 細(xì)胞群，富集 CM1 的患者具有免疫激活狀態(tài)，因此定義為免疫激活型 TIME（TIME-IA）；CM2 富集 Mph_03_SPP1 群并高表達(dá) IL1B，具有髓系免疫抑制特性和促癌趨化因子，且與臨床預(yù)后差正相關(guān)，CM2 富集的患者被定義為髓系免疫抑制型 TIME（TIME-ISM）；CM3 和 CM4 均含有基質(zhì)細(xì)胞，其中 CM3 高表達(dá)腫瘤激活基因，富集胞外基質(zhì)和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）特征，與預(yù)后差正相關(guān)，CM3 患者可以定義為基質(zhì)免疫抑制型（TIME-ISS）；CM4 含有內(nèi)皮和間充質(zhì)細(xì)胞群，缺少免疫細(xì)胞，具有排斥 T 細(xì)胞的 CXCL12+?成纖維細(xì)胞，GZMK+?CD8+?T 細(xì)胞也在該模塊富集但多色免疫組化（mIHC）顯示毒性 T 細(xì)胞被隔離在腫瘤區(qū)域外（圖2f），因此 CM4 富集的患者被定義為免疫排斥型 TIME（TIME-IE）；CM5 含有肝駐留細(xì)胞群，包括駐留 NK 細(xì)胞群、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，與預(yù)后較好正相關(guān)，所以 CM5 富集患者被定義為免疫駐留型 TIME（TIME-IR）。
作者將該分類命名為 TIMELASER（圖2d），生存分析顯示該分型與臨床預(yù)后結(jié)果一致（圖2e），說明了這種分型方法的可靠性和臨床相關(guān)性。作者還用已發(fā)表的單細(xì)胞和批量 RNA 測序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。
另外，作者還發(fā)現(xiàn) TIMELASER 亞型間具有不同的趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)模式（圖2g, h）。例如?CXCL9/10/11-CXCR3?在 TIME-IA 中富集，CXCL1/3/8-CXCR2?在 TIME-ISM 中富集。外顯子組數(shù)據(jù)顯示 TIMELASER 亞型間還具有腫瘤細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)基因突變差異。這些分析說明?TIMELASER 分型不僅表征了患者間的 TIME 差異，還體現(xiàn)了深層次的趨化因子網(wǎng)絡(luò)和腫瘤體細(xì)胞變異差異。
3、肝癌中的中性粒異質(zhì)性及功能

研究得到了共 34,307 個(gè)中性粒細(xì)胞，分為 11 個(gè)亞群，具有明顯的組織和腫瘤類型特異性（圖3a）。Neu_02_S100A12、Neu_03_ISG15 和 Neu_04_TXNIP 是外周血中性粒（PBNs），Neu_05_ELL2 和 Neu_06_PTGS2 是癌旁中性粒（ALNs），另外 6 類富集于腫瘤組織，定義為腫瘤相關(guān)中性粒（TANs）（圖3b）。擬時(shí)序分析揭示了從 PBNs 到 ALNs 再到 TANs 的分化軌跡（圖3a）。調(diào)節(jié)子分析顯示不同來源的中性粒表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子（圖3c），ATAC 結(jié)果驗(yàn)證了這些轉(zhuǎn)錄因子的特異性活化。這些結(jié)果說明了肝癌中中性粒的分化是由不同的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行時(shí)空特異性調(diào)節(jié)的。

作者接下來著重研究 Neu_11_CCL4 和 Neu_09_IFIT1 兩種中性粒亞群。CCL4+?TANs 高表達(dá)?CCL3?和?CCL4（圖3d），病人來源 TANs 相對于非 TANs 具有更高的?CCL4基因活化和 CCL4 蛋白水平（圖3f,g）。趨化實(shí)驗(yàn)顯示 TANs 共培養(yǎng)可以招募單核細(xì)胞（圖3h）。通過體外 PBNs 與肝癌細(xì)胞系的共培養(yǎng)，他們誘導(dǎo)出了類似于 Neu_11_CCL4 亞群的“體外TANs”（圖3e）。這些結(jié)論說明了?TANs 的趨化因子分泌功能和 CCL4+?TANs 對巨噬細(xì)胞的招募作用。

TANs 中還高表達(dá)?CD274（編碼PD-L1）（圖3i），“體外 TANs”也表達(dá)?CD274?并且表達(dá)量隨時(shí)間升高（圖3j），流式分選確定“體外 TANs”高表達(dá) PD-L1 蛋白（圖3k）。ATAC 和流式分選均表明病人來源 TANs 也具有?CD274?活化和 PD-L1 表達(dá)的特性（圖3l, m）。體外 TANs 和病人來源 TANs 與 CD8+?T 細(xì)胞的共培養(yǎng)都顯示 TANs 可以通過高表達(dá) PD-L1 抑制 T 細(xì)胞活性（圖3n-p）。另外 mIHC 展示了 PD-L1+?中性粒和 PD1+?CD8+?T 細(xì)胞的臨近位置關(guān)系（圖3q）。這些實(shí)驗(yàn)表明肝癌中的 PD-L1+?TANs 可以抑制毒性 CD8+?T?細(xì)胞活性。

4、小鼠肝癌模型揭示中性粒的亞群保守性及功能

為了進(jìn)一步研究 TANs 的體內(nèi)的功能異質(zhì)性，研究人員構(gòu)建了兩種基于?Alb-cre/Trp53fl/fl?肝臟特異敲除小鼠和肝癌驅(qū)動(dòng)突變的小鼠肝癌模型（Myc-?90Ctnnb1，pTMC；Myc-KrasG12D，pTMK）。作者取 6 只小鼠的外周血、癌旁和腫瘤共 21 份樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，得到 17,780 個(gè)中性粒細(xì)胞，分為 12 個(gè)細(xì)胞群，這些細(xì)胞群具有組織特異性和明顯的發(fā)育軌跡（圖4a, b）。中性粒亞群間一致的特征基因表達(dá)模式說明了其保守性（圖4c）。人肝癌患者的 TIME-ISM TANs (Neu_09/10/11) 分別對應(yīng)小鼠中性粒亞群 mNeu_10/11/12，而且小鼠 TANs 也高表達(dá)?Cd274（圖4d），這些結(jié)果證明了中性粒亞群的保守性，為后續(xù)在小鼠肝癌模型進(jìn)行中性粒靶向治療建立了基礎(chǔ)。

研究人員通過 anti-Ly6G 抗體去除模型小鼠體內(nèi)的中性粒，中性粒去除后小鼠腫瘤明顯縮?。▓D4e, f），TANs 數(shù)量和 PD-L1 表達(dá)均降低（圖4g），免疫組化驗(yàn)證了中性粒和增殖惡性細(xì)胞的減少（圖4h）。結(jié)果還顯示約 70%的中性粒被去除，浸潤性巨噬細(xì)胞減少 46.6%，CD8+?T 恢復(fù)活性（免疫檢查點(diǎn)標(biāo)記 PD-1 和 TIM3 降低）（圖4g）。熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了腫瘤的縮減（圖4i, j）。對兩只 anti-Ly6G 治療小鼠的骨髓、外周血、癌旁組織和腫瘤的單細(xì)胞測序顯示，大部分 TANs 被去除，但 mNeu_09_Apoa2 亞群增多，該群對應(yīng)人肝癌的 Neu_07_APOA2 亞群與良性預(yù)后正相關(guān)，這類 TANs 高表達(dá)脂質(zhì)代謝特征，可能屬于脂質(zhì)相關(guān)中性粒。總之，小鼠模型中的中性粒去除能夠改變 TANs 組分，有效削弱腫瘤進(jìn)展。

總結(jié)

文章通過分析來源于肝癌和小鼠模型的 130 萬個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一套全新的肝癌的免疫微環(huán)境分型體系：TIMELASER，對于該分型體系的深入分析有助于我們對腫瘤-微環(huán)境和微環(huán)境-微環(huán)境互相作用的理解，輔助發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和免疫治療靶標(biāo)。另一方面，文章揭示了肝癌中性粒的異質(zhì)性，明確表明大部分腫瘤相關(guān)中性粒的促癌作用，并在小鼠模型中驗(yàn)證了去除中性?？梢杂行б种颇[瘤進(jìn)展，為新的肝癌免疫治療靶標(biāo)提供了線索。

參考文獻(xiàn)：

Xue R, Zhang Q, Cao Q, Kong R, Xiang X, Liu H, Feng M, Wang F, Cheng J, Li Z, Zhan Q, Deng M, Zhu J, Zhang Z, Zhang N. Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity.?Nature. 2022 Nov 9. doi: 10.1038/s41586-022-05400-x. Epub ahead of print. PMID: 36352227.