內(nèi)皮細胞（EC）是排列在血管內(nèi)表面具有保護屏障作用的細胞，其功能包括維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)血壓、促進血管生成和控制凝血過程。與人體的其他正常二倍體細胞相同，血管內(nèi)皮細胞的壽命是有限的，隨著分裂次數(shù)的增加，最終進入復制性衰老狀態(tài)。血管內(nèi)皮細胞衰老會導致內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化和高血壓的獨立危險因素。因此，闡明血管內(nèi)皮細胞衰老的潛在分子機制，對與老年性心血管疾病的防治具有重要意義。

環(huán)狀RNA(circRNAs)是一種由反向剪接形成的的內(nèi)源性RNA分子。環(huán)狀內(nèi)含子RNA（ciRNAs）是環(huán)狀RNA的其中一類，是由內(nèi)含子套索前體逃避典型線性剪接的去分支步驟而產(chǎn)生的。circRNA參與各種生理和病理生理過程的調(diào)節(jié)，然而circRNAs在血管內(nèi)皮細胞衰老中的作用尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，一種名為ciPVT1的新型環(huán)狀內(nèi)含子RNA在血管內(nèi)皮細胞衰老過程中差異表達，并且ciPVT1可以抑制血管內(nèi)皮細胞的衰老，并增加血管生成活性。這些發(fā)現(xiàn)表明ciPVT1是血管內(nèi)皮細胞衰老的重要調(diào)節(jié)因子。

廣東醫(yī)科大學衰老研究所熊興東教授在Aging Cell（IF=11.005）上發(fā)表了題為A circular intronic RNA ciPVT1 delays endothelial cell senescence by regulating the miR-24-3p/CDK4/pRb axis的文章。在本項研究中作者發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種起源于PVT1基因內(nèi)含子4的環(huán)狀內(nèi)含子RNA：ciPVT1，其在衰老的血管內(nèi)皮細胞中的表達顯著減少。進一步的功能和機制研究表明，ciPVT1可能通過海綿miR-24-3p作為競爭內(nèi)源性RNA(ceRNAs)來調(diào)節(jié)CDK4及其下游基因，進而延緩血管內(nèi)皮細胞衰老。本文的研究結果揭示了circRNA參與血管內(nèi)皮細胞衰老的具體分子機制，為預防和治療年齡相關的心血管疾病提供新的思路。

1、內(nèi)皮細胞中ciPVT1的鑒定及特性

作者對RNA-seq數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)ciPVT1在兩種衰老的血管內(nèi)皮細胞中均顯著下調(diào)，提示ciPVT1可能在血管內(nèi)皮細胞衰老中發(fā)揮作用。然后，作者通過RT-qPCR、western blot、建立細胞模型等方法，驗證了血管內(nèi)皮細胞中ciPVT1的表達下調(diào)并與細胞衰老相關。隨后作者使用Sanger測序、RNase處理等證實了ciPVT1的來源和特性。以上的結果表明ciPVT1是一個位于PVT1內(nèi)含子4、具有環(huán)狀結構且相對穩(wěn)定的轉錄本，在衰老的血管內(nèi)皮細胞中顯著下調(diào)。

2、ciPVT1延緩內(nèi)皮細胞衰老，促進內(nèi)皮細胞增殖和血管生成能力

作者通過設計siRNA探究ciPVT1在內(nèi)皮細胞衰老中的作用。實驗結果顯示，ciPVT1的沉默和表達下調(diào)，能夠導致細胞形態(tài)學改變，并伴有SA-β-gal活性的增加，影響力內(nèi)皮細胞形成毛細血管網(wǎng)絡的能力。作者又研究了內(nèi)皮細胞的體內(nèi)血管生成活性，發(fā)現(xiàn)si-ciPVT1組顯示較少的心血管形成。HE染色和IHC的結果表明了si-ciPVT1組血管樣結果減少。細胞周期分析發(fā)現(xiàn)si-ciPVT1組S期細胞數(shù)量減少，G1期數(shù)量增加。而過表達ciPVT1則延遲了內(nèi)皮細胞的衰老。這些結果表明ciPVT1參與內(nèi)皮細胞衰老表型的調(diào)節(jié)。

3、ciPVT1可作為miR-24-3p的海綿

作者使用RT-qPCR實驗，證實了ciPVT1主要位于細胞質中。然后，運用生物素標記和RIP實驗來探究能與其互相作用的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-24-3p具有最高的富集度。作者接著運用RNA雜交和雙熒光素酶報告實驗證實了ciPVT1與miR-24-3p的直接作用。隨后，作者進行了RNApull-down和RNA FISH分析進一步證實了二者的相互作用。作者定量分析了血管內(nèi)皮細胞中ciPVT1和miR-24-3p的絕對拷貝數(shù)，結果表明，兩者的拷貝數(shù)相當。此外還發(fā)現(xiàn)，ciPVT1和miR-24-3b并不會被彼此促進降解?？傊陨辖Y果充分證明ciPVT1可作為miR-24-3p的海綿發(fā)揮功能。

4、miR-24-3p促進內(nèi)皮細胞衰老、抑制增殖、損害毛細血管網(wǎng)絡形成能力

作者探討miR-24-3p在血管內(nèi)皮細胞衰老中的作用。結果顯示，過表達miR-24-3p可增加SA-β-gal陽性細胞的數(shù)量，抑制細胞增殖和內(nèi)皮細胞的小管形成能力，證實了miR-24-3p在內(nèi)皮細胞衰老中的關鍵作用。CDK4是細胞周期G1期過渡的關鍵調(diào)節(jié)因子。western blot實驗結果表明過表達miR-24-3p減少了內(nèi)皮細胞CDK4和磷酸化Rb(pRb)蛋白的水平，而miR-24-3p的過表達或抑制并未改變Rb的表達水平。這些結果表明miR-24-3p可以通過CDK4/pRb途徑誘導內(nèi)皮細胞衰老，抑制細胞增殖，并損害內(nèi)皮細胞的小管形成能力。

5、過表達ciPVT1減輕miR-24-3p誘導的內(nèi)皮細胞衰老

作者運用SA-β-gal染色、過表達、設計rescue實驗等方式研究了ciPVT1是否通過與miR-24-3p相互作用而延緩衰老、促進細胞增殖和增加血管生成活性。結果顯示miR-24-3p可促進內(nèi)皮細胞衰老，其作用可被ciPVT1的過表達所阻斷。miR-24-3P可降低內(nèi)皮細胞的成管能力，抑制細胞增殖。同樣，ciPVT1的過表達可以挽救miR-24-3p過表達所誘導的這些表型。這些結果表明ciPVT1通過吸附miR-24-3p延緩血管內(nèi)皮細胞衰老。

圖5.?過表達ciPVT1可減輕miR-24-3p誘導的內(nèi)皮細胞衰老

6、ciPVT1通過調(diào)節(jié)miR-24-3p/CDK4/pRb軸延緩內(nèi)皮細胞衰老

作者發(fā)現(xiàn)ciPVT1過表達后CDK4/pRb的表達上調(diào)，敲低則反之；作者還觀察到外源miR-24-3p可以顯著抑制CDK4的表達，并且在ciPVT1過表達后抑制被延遲。隨后作者又對miR-24-3p上與ciPVT1結合的位點進行突變，發(fā)現(xiàn)缺乏結合miR-24-3p能力的突變體ciPVT1的過表達對細胞衰老、增殖、內(nèi)皮細胞的血管生成活性和CDK4/pRb水平?jīng)]有影響，這表明ciPVT1充當miR-24-3p的海綿，通過內(nèi)皮細胞中的ceRNA機制調(diào)節(jié)CDK4，作者對老年人動脈中的檢測結果證實了這一點。綜上所述，ciPVT1通過miR-24-3p/CDK4/pRb途徑延緩了內(nèi)皮細胞的衰老、促進細胞增殖并增加了血管生成能力。

結論

該項研究對源自PVT1基因內(nèi)含子4的ciRNA進行了表征和功能分析。證明了ciPVT1在衰老的內(nèi)皮細胞中下調(diào)，并首次闡明了環(huán)狀內(nèi)含子RNA在血管內(nèi)皮細胞中的分子機制：ciPVT1通過靶向miR-24-3p/CDK4/pRb途徑延緩血管內(nèi)皮細胞衰老。該項研究的成果表明了ciPVT1可以作為延緩內(nèi)皮細胞衰老及防治相關的血管并發(fā)癥的分子靶點。

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https://doi.org/10.1111/acel.13529

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