現(xiàn)代生物學(xué)把蛋白質(zhì)視作一切細(xì)胞、生物的基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。但是，要想讓生命活動(dòng)有序進(jìn)行，那就必須讓蛋白質(zhì)們?cè)诤线m的時(shí)候“工作”，在工作之后及時(shí)“休息”。因此，蛋白激酶和磷酸酶作為蛋白們的分子開(kāi)關(guān)，控制著蛋白的活化和失活,是所有生物學(xué)反應(yīng)中必不可少的一份子。那么，調(diào)控蛋白激酶的表達(dá)往往能比控制下游的功能蛋白更有效干預(yù)某種生命活動(dòng)。

蛋白激酶研究思路

????? 起初人們研究蛋白激酶十分艱難，大多數(shù)科學(xué)家一般需要確定了某種蛋白在一個(gè)生命活動(dòng)中起決定性作用之后，才會(huì)通過(guò)進(jìn)一步的檢測(cè)，證實(shí)其為蛋白激酶。例如著名的致癌基因Src，人們一開(kāi)始發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒感染的雞細(xì)胞后，將基因整合入細(xì)胞基因組中，成為腫瘤細(xì)胞，通過(guò)src基因促使感染細(xì)胞不斷地增殖。在發(fā)現(xiàn)Src是癌基因后，人們進(jìn)一步確定它編碼的蛋白產(chǎn)物為蛋白激酶。

????? 隨著上世紀(jì)80年代DNA測(cè)序技術(shù)的開(kāi)發(fā)，各種蛋白激酶特征性序列被解析出來(lái)，這一突破大大加速了對(duì)蛋白激酶的挖掘。到如今的基因組時(shí)代，我們已經(jīng)擁有了生物體完整的激酶組信息。我們可以通過(guò)其磷酸化的位點(diǎn)，篩選出潛在的磷酸化靶點(diǎn)。這為我們研究生命過(guò)程的機(jī)制、癌癥的發(fā)展、各種信號(hào)通路的探索提供了莫大的幫助。[1]自第一個(gè)蛋白激酶的抑制劑藥物伊馬替尼(Imatinib)獲得FDA上市批準(zhǔn)以來(lái)，已經(jīng)過(guò)了21年。目前FDA批準(zhǔn)的藥物已經(jīng)將近100種，此外還有更多的蛋白激酶相關(guān)藥物正在開(kāi)發(fā)和臨床測(cè)試。蛋白激酶相關(guān)藥物的問(wèn)世，為治療免疫系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤提供了有力的幫助。許多研究者也對(duì)蛋白激酶的研究充滿熱情，目前研究蛋白激酶的主要套路可以歸結(jié)如下：

?1、找到目標(biāo)蛋白激酶：蛋白激酶作為分子開(kāi)關(guān)，在大多生命活動(dòng)的過(guò)程中，都起著較為重要的作用，在整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中往往起著“四兩撥千斤”的作用。因此，在通過(guò)meta分析或NGS測(cè)序獲得的組學(xué)結(jié)果中，可以優(yōu)先選擇其中的某些具有顯著性差異的蛋白激酶作為干預(yù)靶點(diǎn)。

??????2、抑制劑初步驗(yàn)證假設(shè)：大多數(shù)蛋白激酶都有對(duì)應(yīng)的小分子抑制劑。為了能夠快速驗(yàn)證自己的假設(shè)，我們可以前期利用蛋白激酶相應(yīng)的抑制劑，快速干預(yù)蛋白激酶的活性或者表達(dá)情況，來(lái)探究蛋白激酶在信號(hào)傳導(dǎo)通路中是否起重要作用。但在觀察到小分子抑制劑能夠明顯干預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)后，為了得到更可靠的數(shù)據(jù)，我們可以進(jìn)一步通過(guò)基因編輯，準(zhǔn)確地敲除或過(guò)表達(dá)目的基因，觀察相應(yīng)的結(jié)果。這樣得到的數(shù)據(jù)可能會(huì)更加可靠。

????? 3、進(jìn)一步尋找下游磷酸化靶標(biāo)：在研究蛋白激酶的信號(hào)通路時(shí)，往往需要尋找蛋白激酶的下游磷酸化靶標(biāo)。在如果沒(méi)有任何線索的情況下，我們可以嘗試使用磷酸化組學(xué)，進(jìn)行高通量篩選。隨后選擇理想的目的靶點(diǎn)，進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)，以及與蛋白激酶的蛋白互作的驗(yàn)證。也可以通過(guò)基因編輯，敲除下游靶蛋白，來(lái)驗(yàn)證蛋白激酶的功能。

????? 4、進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：對(duì)于研究蛋白激酶在疾病中的影響時(shí)，我們可以先選擇合適的細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)完成之后，可以考慮進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)論的可靠性。我們可以通過(guò)構(gòu)建cas9-gRNA的AAV，進(jìn)步病毒靶點(diǎn)干預(yù)；也可以通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定的CKO或KO動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

雖然蛋白激酶的研究熱度不減，但目前仍有大量的蛋白激酶的作用并不明確，許多較為熟悉的蛋白激酶仍在許多未知信號(hào)通路中起著重要的作用。不過(guò)，隨著CRISPR/Cas9的技術(shù)日漸成熟，精準(zhǔn)敲除某個(gè)基因已經(jīng)不再困難，研究某些蛋白激酶時(shí)可以不再把時(shí)間花在特異性抑制劑的尋找上。這為研究蛋白激酶提供了莫大的便利。下面給就大家分享幾篇近期利用CRISPR/Cas9研究蛋白激酶作用的文章，供大家參考！

應(yīng)用案例

1、細(xì)胞凋亡膜泡形成機(jī)制的研究

???????凋亡膜泡的形成是凋亡細(xì)胞解體過(guò)程中最具特征的步驟，并且人們認(rèn)為ROCK1、PAK2 和 LIMK1這三個(gè)激酶在調(diào)控凋亡膜泡中起重要作用。而2020年Ivan Poon團(tuán)隊(duì)在Cell Death & Differentiation?發(fā)表的“ROCK1 but not LIMK1 or PAK2 is a key regulator of apoptotic membrane blebbing and cell disassembly”一文，通過(guò)基因編輯的手段，詳細(xì)闡述了其中只有ROCK1是凋亡膜泡形成的關(guān)鍵激酶[2]。Poon團(tuán)隊(duì)在Jurkat細(xì)胞上誘導(dǎo)凋亡，然后分別利用小分子化合物GSK-269962抑制ROCK1，F(xiàn)RAX-1036抑制PAK2，BMS-5抑制LIMK1進(jìn)行抗凋亡干預(yù)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入GSK-269962這個(gè)ROCK1抑制劑之后，凋亡膜泡的形成明顯減少了，而加入其他兩個(gè)激酶的抑制劑之后，凋亡膜泡仍然產(chǎn)生。這表明，原先人們認(rèn)為的3個(gè)激酶中，只有ROCK1是產(chǎn)生凋亡膜泡所必要的蛋白激酶。

由于目前大多數(shù)小分子抑制劑都存在靶向不特異的局限性。就拿GSK-269962為例，在抑制ROCK1（IC50為1.6nM）的同時(shí)，其還對(duì)ROCK2有部分抑制效果（IC50為4nM），此外，目前已知的GSK-269962抑制靶點(diǎn)還包括RSK1,MSK1,AKT1,AKT2,AKT3。這無(wú)疑是給機(jī)制探究工作造成了很大的難度。

?????? 因此，Poon團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功構(gòu)建出ROCK1-/-Jurkat細(xì)胞系。并且測(cè)試了敲除ROCK1之后，細(xì)胞系在面對(duì)Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡時(shí)，凋亡膜泡的形成情況。其中克隆1的在細(xì)胞凋亡過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的表面和動(dòng)態(tài)凋亡膜泡發(fā)生減少。

???????同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建了PAK2-/-以及LIMK-/-的細(xì)胞系，同樣進(jìn)行了凋亡膜泡形成的觀察。結(jié)果表明，與敲除ROCK1不同的是，敲除PAK和LIMK并沒(méi)有阻止細(xì)胞凋亡是細(xì)胞膜起泡的發(fā)生。總而言之，該研究通過(guò)抑制劑和基因編輯手段，表明?ROCK1，是凋亡膜泡形成的必要調(diào)節(jié)因子，而在此過(guò)程中，PAK和LIMK并非必要的蛋白激酶。

源井已成功推出超3000種KO細(xì)胞現(xiàn)貨，涵蓋27個(gè)信號(hào)通路、26種疾病類(lèi)型及5大類(lèi)藥物靶點(diǎn)，上述提及的ROCK1基因已有相關(guān)敲除細(xì)胞在庫(kù)，優(yōu)質(zhì)純合速遞僅需1周，歡迎復(fù)制了解詳情>>https://www.ubigene.com/product/KO%20Cell%20Line.html

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2、乳腺癌侵襲的信號(hào)通路研究

????? 在乳腺癌，以及所有的癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，都伴隨著蛋白激酶的表達(dá)異常。研究清楚這些蛋白激酶在信號(hào)通路中發(fā)揮作用的信號(hào)通路是尋找治療抗癌靶點(diǎn)的重要手段。Wei-zhou Zhang團(tuán)隊(duì)在Cells發(fā)表的”ROR1 Potentiates FGFR Signaling in Basal-Like Breast Cancer“一文中，總結(jié)過(guò)去的工作結(jié)果，發(fā)現(xiàn)受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)?在基底樣乳腺癌，以及其他類(lèi)型的癌癥中均過(guò)度表達(dá)，并且其過(guò)表達(dá)的程度與患者預(yù)后有著明顯的相關(guān)性。[3]

???????Zhang團(tuán)隊(duì)首先利用流式分選，將患者來(lái)源的腫瘤團(tuán)塊中分選出ROR1陽(yáng)性和ROR1陰性的腫瘤細(xì)胞群，分別移植到NSG小鼠中。8個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)移植了ROR1陽(yáng)性細(xì)胞的小鼠已經(jīng)形成了明顯的腫瘤團(tuán)塊，而移植了ROR1陰性細(xì)胞群的小鼠未形成任何腫瘤。

?隨后，Zhang團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功構(gòu)建出ROR1敲除的MDA-MB-231細(xì)胞系，利用KO的細(xì)胞系與WT細(xì)胞系進(jìn)行了后續(xù)的蛋白水平分析。結(jié)果表明，ROR1能夠調(diào)控下游FGFR的表達(dá)水平。而在CRISPR/Cas9構(gòu)建出的ROR1敲除的細(xì)胞系中，敲除細(xì)胞失去了上調(diào)FGFR蛋白水平的能力，F(xiàn)GFR?蛋白處于較低水平，下游的pAKT也有明顯的降低，并且癌細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。由此蛋白激酶ROR1在基底樣乳腺癌中的作用機(jī)制得以證實(shí)，同時(shí)ROR1將是癌癥治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，并且能夠作為一種腫瘤標(biāo)記物用于乳腺癌的篩查。

3、細(xì)胞葡萄糖代謝機(jī)制的研究

???????蛋白激酶的磷酸化作用在糖代謝中起著關(guān)鍵性的作用。丙酮酸激酶M (PKM)是葡萄糖代謝的關(guān)鍵蛋白。PKM能夠使得腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有氧糖酵解反應(yīng)，即所謂的Warburg效應(yīng)。然而PKM促進(jìn)有氧糖酵解的機(jī)制尚不明確。近期Bing-hui Li團(tuán)隊(duì)在Cancer Biology and Medicine發(fā)表的一文中詳細(xì)闡述了PKM調(diào)控的代謝途徑。[4]

???????Li團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-Cas9技術(shù)，針對(duì)PKM的兩種亞型，成功構(gòu)建出PKM1-KO, PKM2-KO?的4T1細(xì)胞系，以及PKM-KO的4T1細(xì)胞系。利用同位素標(biāo)記的葡萄糖和谷氨酰胺，觀察糖代謝后續(xù)產(chǎn)物的生成量，發(fā)現(xiàn)PKM降低了為細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖存量水平，因而提高了α-酮戊二酸/檸檬酸的比值，以此促進(jìn)通過(guò)還原途徑產(chǎn)生谷氨酰胺衍生的乙酰輔酶A。

隨后通過(guò)后續(xù)的在體實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了PKM2?在促進(jìn)還原性谷氨酰胺代謝和維持質(zhì)子穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，闡述了PKM2對(duì)正常細(xì)胞生理功能的重要性，提示抑制?PKM2?不是治療癌癥的優(yōu)先策略。

從上述的三個(gè)研究案例中可以發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9技術(shù)在其中成為了一種精準(zhǔn)控制變量的高效手段，這都有賴于CRISPR/Cas9技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。源井生物一直致力于CRISPR/Cas9基因編輯細(xì)胞，擁有較傳統(tǒng)技術(shù)編輯效率高10-20倍的CRISPR-U?專(zhuān)利技術(shù)，可提供ROR1、PKM等超3000種敲除細(xì)胞現(xiàn)貨，也可提供快至4周KO細(xì)胞極速定制服務(wù)滿足你不一樣的科研需求，歡迎復(fù)制了解詳情>>https://www.ubigene.com/service/cell/knockout.html

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參考文獻(xiàn)：

[1]?Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T. & Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome.?Science?298, 1912-1934, doi:10.1126/science.1075762 (2002).

[2]?Tixeira, R.?et al.?ROCK1 but not LIMK1 or PAK2 is a key regulator of apoptotic membrane blebbing and cell disassembly.?Cell Death Differ?27, 102-116, doi:10.1038/s41418-019-0342-5 (2020).

[3]?Pandey, G.?et al.?ROR1 Potentiates FGFR Signaling in Basal-Like Breast Cancer.?Cancers (Basel)?11, doi:10.3390/cancers11050718 (2019).

[4]?Liu, M.?et al.?PKM2 promotes reductive glutamine metabolism.?Cancer Biol Med?15, 389-399, doi:10.20892/j.issn.2095-3941.2018.0122 (2018).