BCECF-AM,PH敏感探針（117464-70-7）是一種對細(xì)胞內(nèi)pH敏感的新型熒光探針，分別用490nm和440nm波長激發(fā)BCECF所得到的發(fā)射熒光之比與pH有很好的線性關(guān)系。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF，BCECF-AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，BCECF-AM沒有熒光，進入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成BCECF，從而被留在細(xì)胞內(nèi)。BCECF在適當(dāng)?shù)膒H值情況下可以被激發(fā)形成綠色熒光。

檢測原理

核仁是形成核的結(jié)構(gòu)之一，并成為核糖體生物發(fā)生的起點。 核仁中有許多核糖體RNA（rRNA），進行rRNA的轉(zhuǎn)錄和加工。 雖然核仁的形態(tài)變化被認(rèn)為是癌癥診斷的指標(biāo)之一，但也有一些科學(xué)報道描述了核仁與 DNA 損傷、自噬、病毒感染和細(xì)胞衰老之間的關(guān)系。 Nucleolus Bright 染料是小分子，它們與核仁中的 RNA 結(jié)合以發(fā)射熒光。 用 Nucleolus Bright 染料染色后，無需任何洗滌步驟即可觀察到核仁。
Nucleolus Bright 對存在于核仁之外的 RNA 起反應(yīng)，但它在核仁中顯示出強烈的熒光，這是 rRNA 產(chǎn)生的位點。 我們建議與 DAPI 共同染色，以便清晰地成像核仁。

BCECF, AM(117464-70-7) 介紹：
BCECF被廣泛地用于細(xì)胞內(nèi)pH的測定。加入2個額外的羧化物基團改進了這種羧基熒光素。加入的兩個羧基使得它能更好地被固定在細(xì)胞內(nèi)。BCECF具有很好的水溶性，是因為它在中性pH時帶有4-5個負(fù)電荷。但是BCECF卻很難穿過細(xì)胞膜進入到細(xì)胞內(nèi)。它的pKa值為6.97，高于其它的羧基熒光素。BCECF在激發(fā)光譜439nm處有等吸收點，因此它能和Fura 2一樣可用比率法測定。505nm和439nm通常是非常有用的用于比率測量的波長，一般會將490nm和450nm的濾光片加在激發(fā)光源的前面。而530nm的濾光片則是用來查看它的熒光信號的。這里要注意的是激發(fā)光譜與吸收光譜有一些細(xì)微的區(qū)別。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF。它能夠輕易地進入到細(xì)胞內(nèi)。就和其他的乙酰甲酯類一樣，BCECF-AM只需要通過孵育就能進入細(xì)胞。BCECF-AM對潮濕非常敏感，所以要小心保存。如果DMSO儲存液的顏色從淺黃色變?yōu)樯畛壬痛砹薃M的分解。所以通過對顏色變化的觀測，能判斷AM酯的水解情況。

BCECF/AM, a membrane-permeable fluorescent indicator for the measurement of cytoplasmic pH with an Abs/Em = 503/520 nm. BCECF/AM readily and rapidly diffuses through cell membranes. BCECF/AM is an acetoxymethyl ester of BCECF, is a variable mixture of cell-permeable ester derivatives of BCECF that are hydrolyzed by cytosolic esterases to yield intracellularly trapped indicator BCECF. BCECF/AM is a selective vacuolar accumulation of the fluorescent pH-indicator used to monitor intracellular pH changes in mammalian fibroblasts, gastric cells, lymphocytes, myocytes, and distal convoluted tubules.

BCECF-AM不僅被廣泛用于哺乳動物細(xì)胞的研究，也有報道用于動物組織、植物細(xì)胞、細(xì)菌和酵母等的細(xì)胞內(nèi)pH水平檢測。在有細(xì)胞內(nèi)pH變化的細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、藥物抵抗、細(xì)胞趨化等過程中BCECF AM被廣泛應(yīng)用。BCECF-AM(pH熒光探針)需用無水DMSO(anhydrous DMSO)配制。

?Maximum Excitation WavelengthMaximum Emission WavelengthFluorescence of MeOH fixed cellsFluorescence of PFA fixed cellsNucleolus Bright Green513 nm538 nm〇〇Nucleolus Bright Red537 nm605 nm〇〇

核仁檢測
用 4% PFA 或 MeOH 固定 HeLa 細(xì)胞后，用 PBS 洗滌細(xì)胞，然后用 1% Triton X-100 透膜。 加入核仁亮綠或核仁亮紅 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用共聚焦顯微鏡成像。觀察到 DAPI 染色的細(xì)胞核（藍色）中的幾個核仁。

<染色條件>
- 用 PFA 固定
將細(xì)胞浸入 4% PFA 中 5 分鐘，Triton X-100 中 20 分鐘。 然后在每個熒光探針中孵育 60 分鐘。
- 用甲醇固定
將細(xì)胞浸入冷 MeOH 中 1 分鐘，Triton X-100 中 20 分鐘。 然后在每個熒光探針中孵育 5 分鐘。

<檢測條件>
核仁亮綠色 Ex. 488nm / Em. 500-600nm
核仁鮮紅 Ex. 561nm / Em. 565-650nm
DAPI Ex. 405nm / Em. 450-495nm

核仁定位
第 3 代 WI-38 細(xì)胞用 4% PFA 固定，用抗原纖維蛋白一抗和二抗進行免疫染色。 加入核仁亮綠或核仁亮紅 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用落射熒光顯微鏡 (Keyence, BZ-X710) 進行成像。

<檢測條件>
核仁亮綠色：Ex. 450-490 nm / Em. 500-550 nm
核仁亮紅色：Ex. 533-548 nm / Em. 570-640 nm
DAPI：Ex. 340-380nm / Em. 435-485nm
抗原纖維蛋白抗體：Ex. 590-650 nm / Em. 668-733 nm

檢測衰老細(xì)胞
不同代的 WI-38 細(xì)胞用 4% PFA 固定并用 PBS 洗滌。 然后用 1% Triton X-100 滲透膜。 加入核仁亮綠或核仁亮紅 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用共聚焦顯微鏡成像。

<染色條件>
將細(xì)胞浸入 4% PFA 中 5 分鐘，Triton X-100 中 20 分鐘。 然后在每個熒光探針中孵育 5 分鐘。

<檢測條件>
核仁亮綠色：Ex. 488 nm / Em. 500-600 nm
核仁亮紅色：Ex. 561 nm / Em. 565-650 nm
DAPI：Ex. 405nm / Em. 450-495nm

用共焦定量圖像細(xì)胞儀進行定量
不同傳代數(shù)的WI-38細(xì)胞固定后用Nucleolus Bright Green和DAPI染色。 然后使用共焦定量圖像細(xì)胞儀 CQ1 分析每個染色的細(xì)胞。通過成像數(shù)據(jù)分析核仁在 405 nm 和 488 nm 處測量細(xì)胞核和核仁成像數(shù)據(jù)作為發(fā)射波長，并通過 CellPathfinder 分析細(xì)胞核中的核仁數(shù)量。

核仁數(shù)目分析
如第 19 代細(xì)胞中所見，含有一個核仁的細(xì)胞比例增加，而含有一個以上核仁的細(xì)胞減少。該結(jié)果與已發(fā)表報告的數(shù)據(jù)一致。 一份報告表明，衰老的 WI-38 細(xì)胞中的核仁數(shù)量減少了。 另一份報告表明，SETD8 敲低衰老細(xì)胞中的核仁數(shù)量和總面積發(fā)生了變化。

*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.
*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.

Excitation & Emission