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2020年12月31日，美國明尼蘇達大學Natalia Y. Tretyakova教授團隊在《Int J Mol Sci》雜志發(fā)表題為“Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model”的研究文章，該研究通過簡化基因組甲基化測序（RRBS）+氧化簡化基因組甲基化測序（oxRRBS）及對應的轉錄組測序（RNA-seq）揭示炎癥性腸病 (IBD)導致基因組中甲基化和羥甲基化模式變化，表明了IBD導致發(fā)育異常的表觀遺傳機制。

標題：Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model （Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中炎癥性腸病誘導增生/發(fā)育異常的多組學表征）

時間：2020-12-31

期刊：International Journal Of Molecular Sciences

影響因子：IF 6.208

技術平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、RT-qPCR等

研究摘要：

假設表觀遺傳失調在炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）和結腸癌發(fā)展之間的關聯(lián)中發(fā)揮作用。本研究對從肝螺桿菌（H.hepaticus）感染的IBD小鼠模型中收獲近端結腸組織，并進行DNA甲基化組、DNA羥甲基化組和轉錄組分析。RRBS和oxRRBS分析共鑒定出1606個差異甲基化區(qū)域（DMR）和3011個差異羥甲基化區(qū)域（DhMR），與胃腸疾病、炎性疾病和癌癥相關的基因和這些DMR/DhMR重疊。RNA-seq揭示了許多與炎癥和癌癥相關的基因顯著表達變化，包括Duox2、Tgm2、Cdhr5和Hk2在內的幾個基因在DNA甲基化/羥甲基化和基因表達水平上均表現(xiàn)出變化?？傮w而言，本研究結果表明，慢性炎癥會引發(fā)基因組中DNA甲基化和羥甲基化模式的變化，從而改變關鍵腫瘤發(fā)生基因的表達，并可能導致結直腸癌的發(fā)生。

項目設計：

（1）樣本選取：

IBD與正常小鼠近側腸道組織的5mC、5hmC、表達圖譜分析

（2）項目設計流程圖：

（1）肝螺桿菌（H. hepaticus）感染的Rag2-/-/Il10-/-小鼠結腸組織的組織病理學分析

圖1：炎癥性腸?。↖BD）與正常組織的組織病理學檢驗

1. 動物研究設計：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在6-7周齡時H.hepaticus感染或無菌培養(yǎng)基處理（對照），并在感染后20周處死

2. 感染H.hepaticus（橙色）的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠和僅用鹽水處理的對照小鼠（藍色）的結腸組織的組織病理學結果：通過對胃腸道不同部位的炎癥、水腫、上皮缺陷、隱窩萎縮、增生和發(fā)育異常（Dysplasia）的個體評分求和來計算組織學活性指數(shù)（n=7）

3. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃腸道不同部位的整體5-甲基胞嘧啶（5mC）水平，（盲腸每組n=4，橫結腸每組n=3，近端和遠端結腸每組n=7）

4. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃腸道不同部位的整體5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）水平

（2）炎癥性腸?。↖BD）誘導的增生/發(fā)育異常中DNA甲基化和DNA羥甲基化表征

圖2：差異甲基化區(qū)域（DMR）和差異羥甲基化區(qū)域（DhMR）富集的基因在與癌癥發(fā)生和胃腸疾病相關的基因富集。

1. RRBS和oxRRBS技術示意圖：通過比較RRBS和oxRRBS數(shù)據(jù)集分析5mC和5hmC水平。

B-C. 通過RRBS與oxRRBS結合鑒定1606個DMR（B）和3011個DhMR（C）的熱圖。

D-E. 通過Ingenuity Pathway Analysis（IPA），使用顯著性閾值p=0.05的Fisher精確檢驗，預測受DMR（D）和DhMR（E）基因影響的功能和疾病。

（3）差異甲基化分析揭示IBD誘導的增生/發(fā)育異常中存在廣泛的DMR和DhMR

圖3：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在H.hepaticus誘導炎癥在單核苷酸分辨率下的甲基化和羥甲基化動態(tài)變化

1. 784個低DMR，822個高DMR，1454個低DhMR和1557個高DhMR的基因組分布餅圖

2. DMR/DhMR內每個CpG位點5mC和5hmC的動態(tài)變化。0.1是5mC/5hmC水平顯著性變化的截止值。數(shù)字代表點數(shù)量。

表1：H.hepaticus誘導的Rag2?/?/Il10?/?小鼠炎癥CpG位點IPA差異甲基化和羥基甲基化的經典通路

（4）IBD誘導增生/發(fā)育異常中的基因表達變化

圖4：炎癥性腸?。↖BD）和對照小鼠中近端結腸的轉錄組分析

1. 基于最高方差的500個基因的無監(jiān)督分層聚類，顯示對照組和IBD組之間明顯分離

2. IPA鑒定上游調控因子Il10ra周圍的網(wǎng)絡

3. 使用顯著性閾值p=0.05的Fisher精確檢驗，預測受差異表達基因影響的疾病和功能

（5）DNA甲基化異常調控差異表達基因的綜合分析

圖5：IBD誘導的轉錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組變化之間的相關性

A-B. 差異表達且DMR（A）或DhMR（B）富集的基因散點圖。顏色表示不同基因組表征，點大小表示每個區(qū)域的CpG數(shù)量。

1. DNA表觀遺傳標記在IBD誘導的結直腸癌（CRC）發(fā)生中的作用的模型。

總結：

本研究采用RRBS+oxRRBS在H.hepaticus感染的IBD Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中，分別繪制了IBD誘導的DNA羥甲基化和DNA甲基化在全基因組中的變化。同時結合RNA-seq基因表達分析，研究結果首次全面揭示了結腸炎癥誘導的表觀遺傳學變化，為進一步研究IBD生物標志物的發(fā)現(xiàn)提供了有用的信息，并有可能促進IBD新療法的未來發(fā)展。

關于易基因精準DNA甲基化/羥甲基化測序（oxBS-seq）

羥甲基化5hmC是哺乳動物基因組上的第六堿基，在發(fā)育、衰老、神經退行性疾病、復雜疾病及腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。DNA羥甲基化是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)之前被認為是檢測DNA甲基化標準的重亞硫酸鹽測序并不能區(qū)分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。

易基因聯(lián)合劍橋大學建立了化學氧化法結合重亞硫酸鹽轉化的測序技術（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結合同時單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。

傳統(tǒng)BS轉化無法區(qū)分5mC和5hmC

傳統(tǒng)的Bisulfite測序中，5hmC經過Bisulfite處理后變?yōu)镃MS，CMS在測序中仍然被讀作C堿基，因此不能區(qū)分5mC和5hmC。

oxBS技術原理

技術優(yōu)勢：

• DNA甲基化檢測全新的“標準”；

• 單堿基檢測DNA羥甲基化修飾；

• 多重質控標準檢測氧化效率和Bisulfite轉換率；

• 實驗偏好性低，重復性高（R2＞0.98）；

• 易基因自主研發(fā)的甲基化特異性多重PCR引物設計軟件；

• 可滿足多種測序應用需求：

• 全基因組氧化甲基化測序（oxWGBS）

• 簡化基因組氧化甲基化測序（oxRRBS）

• 目標區(qū)域靶基因氧化甲基化測序（Target-oxBS）。

技術路線：

技術指標：

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，技術詳情請致電易基因。

參考文獻：

Han Q, Kono TJY, Knutson CG, Parry NM, Seiler CL, Fox JG, Tannenbaum SR, Tretyakova NY. Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.