在過去的十年中，RNA-Seq技術(shù)迅速發(fā)展，因為能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理，所以廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。由于RNA本身不穩(wěn)定，而mRNA只占抽提總RNA的3%-4%，且RNA-seq最常用的磁珠富集法對于RNA的完整度要求也很高，所以，提取作為科研實驗開始的第一步是十分重要的一個環(huán)節(jié)。

今天小歐就來為大家?guī)硖崛〗绲目▽毜?，一起來了解RNA提取液氮研磨組織時的注意事項吧~

一、液氮研磨重要性

1、 由于RNA的分子結(jié)構(gòu)特點，RNA極易降解，液氮可以使樣本組織瞬間達到低溫狀態(tài)，抑制組織內(nèi)源性RNase降解RNA；

2、 由于液氮極低的溫度可以使樣本組織和細胞都變得很脆（對，就是嘎嘣脆的那種~），通過研磨便于細胞的破碎，釋放出細胞內(nèi)部的核酸；

3、組織的勻漿過程是RNA提取是否成功的關(guān)鍵步驟之一，液氮研磨可以保持組織在勻漿過程中持續(xù)處于低溫狀態(tài)，防止研磨過程中RNA的降解；

二、液氮研磨的原理(研缽)

液氮的溫度為一196℃,它既能使各種組織成分不易被破壞或降解（終止細胞內(nèi)外一切生物反應(yīng)，又能使組織變硬,脆性增加易于磨碎）。

三、液氮研磨流程

1.?滅菌

研缽的滅菌180度烘2h，每份樣本使用單獨的研缽、鑷子、剪刀等取樣工具，防止交叉污染，且取樣工具需要遠離垃圾桶，防止污染樣本。

2.?預(yù)冷

1)?用記號筆在收集管蓋上和管壁上，都寫上樣品名稱；

2)?將樣品、收集管、勺子放在液氮中預(yù)冷；

3)?將液氮小心加入并浸滿研缽，浸泡預(yù)冷研杵與研缽（加入液氮時，緩慢加入，防止液氮飛濺），一般加兩次液氮就很好的預(yù)冷了。

3.放入組織
????將組織迅速轉(zhuǎn)移至液氮內(nèi)，確保組織全部浸沒在液氮中。

4.破碎

使用研杵在液氮中輕輕敲打組織，將組織打碎成小塊，要注意切勿用力過度，要防止組織塊飛濺出研缽；在液氮即將揮發(fā)完時，使用研杵對組織樣本進行碾壓研磨。注意研磨過程要朝著一個方向研磨。

5.中途補充液氮

待液氮揮發(fā)完后，立即加入1/3研缽體積的液氮(注意，加入液氮速度要緩慢，切勿使得液氮沖擊力過大，將組織樣本沖出研缽）。

6.?充分研磨2-3次

迅速用研杵研磨組織，根據(jù)組織狀態(tài)的變化程度，在確保組織始終處于冰凍狀態(tài)下，及時補充液氮進行研磨，直至組織被研磨成粉末狀。

7.收集聚攏樣品

最后再補充一次液氮聚攏粉末，用勺子攪拌粉末，待液氮揮發(fā)完全粉末泛白。

8.裝取樣品

用長鑷子取出液氮中的樣品收集管，用勺子挖取適量粉末樣本至收集管中，且要注意，手指不要捏住收集管的管底，要抓住管口的位置，收取后蓋好蓋子并迅速投入液氮保存；剩余多余樣品收集至合適的樣品管中，也要迅速投入液氮。

四、注意事項

1.個人防護：佩戴棉手套，注意液氮飛濺凍傷；液氮、裂解液均對人體有危害，注意避免直接皮膚接觸，禁止在該實驗中穿短褲、涼鞋等會暴露皮膚的服裝，必要時可以帶上護目鏡以保護面部安全；
2.勺子離心管需要預(yù)冷；
3.研磨過程中使用的器材均需滅菌；
4.研磨程度越細越好。

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