口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤，其轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后差的主要原因。自噬可通過減輕各種細(xì)胞應(yīng)激促進(jìn)OSCC的發(fā)展。然而，自噬在OSCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不清楚。

2022年4月25日，上海交通大學(xué)張志愿教授團(tuán)隊(duì)、浙江大學(xué)周舟教授團(tuán)隊(duì)和陸軍軍醫(yī)大學(xué)皮會(huì)豐教授團(tuán)隊(duì)合作在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF 18.187）上發(fā)表了題為“NUPR1 promotes the proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma cells by activating TFE3-dependent autophagy”的研究論文，該研究使用Labelfree定量蛋白組學(xué)方法分析顯示，核蛋白 1 (NUPR1) 是有或無淋巴轉(zhuǎn)移OSCC患者的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)腫瘤樣本中最顯著上調(diào)的蛋白，NUPR1 在 OSCC 組織中異常表達(dá)，可能與 OSCC 患者的總體存活率較低。此外該研究使用TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)方法分析顯示NUPR1通過直接增加轉(zhuǎn)錄因子E3 (TFE3)活性來維持自噬流和溶酶體功能，進(jìn)而促進(jìn) OSCC 細(xì)胞增殖和體內(nèi)外轉(zhuǎn)移。本研究中NUPR1-TFE3介導(dǎo)的自噬過程為靶向OSCC進(jìn)展的藥物治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。中科新生命為本研究提供了Labelfree非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)和TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)的技術(shù)支持。

研究材料

有和無淋巴轉(zhuǎn)移的OSCC的FFPE樣本、Cal27和HN6癌細(xì)胞系、OSCC組織和正常粘膜組織

技術(shù)路線

步驟1：Labelfree蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NUPR1在有淋巴轉(zhuǎn)移的OSCC的FFPE樣本中顯著上調(diào)；

步驟2：NUPR1與患者的OSCC進(jìn)展及不良預(yù)后呈正相關(guān)；

步驟3：蛋白組學(xué)揭示自噬在NUPR1介導(dǎo)的OSCC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用；

步驟4：NUPR1的敲低阻斷了OSCC細(xì)胞中的自噬流；

步驟5：NUPR1的敲低不抑制OSCC細(xì)胞自噬體的形成和成熟；

步驟6：NUPR1敲低不影響OSCC細(xì)胞中的自噬體-溶酶體的融合；

步驟7：NUPR1的敲低抑制了OSCC細(xì)胞中溶酶體的功能；

步驟8：TFE3負(fù)責(zé)OSCC細(xì)胞中NUPR1介導(dǎo)的自噬溶酶體過程；

步驟9：在體外和體內(nèi)，NUPR1通過激活TFE3依賴的自噬促進(jìn)OSCC的進(jìn)展。

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研究結(jié)果

1. Labelfree蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NUPR1在有淋巴轉(zhuǎn)移的OSCC的FFPE樣本中顯著上調(diào)

作者首先對來自有淋巴轉(zhuǎn)移（LNM）和沒有淋巴轉(zhuǎn)移(non-LNM)的OSCC患者的FFPE腫瘤樣本（分別為10個(gè)樣本）進(jìn)行了Labelfree非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)分析（圖1a）。此次共鑒定到3021個(gè)蛋白，LNM vs non-LNM組的比較分析顯示208個(gè)蛋白顯著上調(diào)，其中NUPR1蛋白是上調(diào)倍數(shù)前五的蛋白（圖1c）。

2. NUPR1與患者的OSCC進(jìn)展及不良預(yù)后呈正相關(guān)

為驗(yàn)證蛋白組學(xué)的結(jié)果，作者采用IHC的方法進(jìn)行了NUPR1的組織芯片（TMA）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明NUPR1表達(dá)水平在OSCC組織中(n = 88)相較于正常粘膜組織(n = 20) 顯著增加（圖2a和2c）。NUPR1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析表明NUPR1與OSCC轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（圖2b、2d和2e）。此外，Kaplan-Meier生存分析顯示NUPR1高表達(dá)的OSCC患者總生存率較低(圖2f)。

為了進(jìn)一步闡明NUPR1在OSCC進(jìn)展中的作用，作者在高表達(dá)NUPR1的OSCC細(xì)胞系（Cal27和HN6癌細(xì)胞系）中將NUPR1敲除。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，NUPR1敲低后顯著降低了OSCC癌細(xì)胞的集落形成效率（圖2g）。傷口愈合和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NUPR1敲低的癌細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯受到抑制（圖2h-2j）。綜上所述，NUPR1 敲低有效地抑制了OSCC的進(jìn)展，表明了NUPR1與OSCC的進(jìn)展的正相關(guān)性。

3. 蛋白組學(xué)揭示自噬在NUPR1介導(dǎo)的OSCC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用

為了揭示NUPR1在OSCC進(jìn)展中的潛在機(jī)制，作者采用TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)的方法檢測了NUPR1敲低的Cal27癌細(xì)胞和對照組細(xì)胞間的蛋白變化。比較分析顯示與對照組相比，NUPR1敲低的Cal27癌細(xì)胞中27個(gè)蛋白顯著上調(diào)、28個(gè)蛋白顯著下調(diào)（圖3a）。差異蛋白的KEGG通路富集分析表明，自噬通路顯著富集(圖3b)，這意味著自噬可能在NUPR1介導(dǎo)的OSCC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

4. NUPR1的敲低阻斷了OSCC細(xì)胞中的自噬流

為驗(yàn)證NUPR1的敲低是否影響OSCC細(xì)胞中的自噬流，作者分析了自噬體形成的標(biāo)志物MAP1LC3B-II（微管相關(guān)蛋白輕鏈3）的變化，結(jié)果顯示在Cal27和HN6癌細(xì)胞將NUPR1敲低后，MAP1LC3B-II表達(dá)水平均增加（圖4a和4b），以及SQSTM1（選擇性自噬接頭蛋白）的表達(dá)水平也明顯增加（圖4a和4b）。然而在癌細(xì)胞中將NUPR1敲低同時(shí)加入氯喹(CQ)（自噬以及自噬流的抑制劑）時(shí)，NUPR1敲低誘導(dǎo)的MAP1LC3B-II的表達(dá)增加不受影響(圖4c和4d)。綜上所述，在OSCC細(xì)胞中，NUPR1的敲低可抑制自噬流。

5. NUPR1的敲低不抑制OSCC細(xì)胞自噬體的形成和成熟

由于自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)循環(huán)系統(tǒng)，具有多個(gè)步驟（①自噬泡的形成②Atg5-Atg12-Atg16L復(fù)合物形成并與自噬泡融合③微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）與自噬泡結(jié)合形成自噬體④自噬體捕獲需降解或清除的蛋白質(zhì)等物質(zhì)⑤自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體、內(nèi)容物降解），作者進(jìn)一步研究了NUPR1敲低在早期或晚期誘導(dǎo)的自噬抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)ATG5 沉默降低了NUPR1敲低誘導(dǎo)的Cal27和HN6細(xì)胞GFP-LC3（自噬體的特異性標(biāo)記物）的增加（圖5a和5b），也降低了MAP1LC3B-II的積累（圖5c和5d），表明NUPR1的敲除不影響自噬體的形成。多泛素蛋白聚集物是成熟自噬體的重要組成部分，其形成是由SQSTM1介導(dǎo)的，作者通過評估GFP-LC3與SQSTM1的共定位來評估自噬小體的成熟。結(jié)果表明NUPR1的敲低并不促進(jìn)OSCC細(xì)胞中自噬體的成熟（圖5e和5f）。

6. NUPR1敲低不影響OSCC細(xì)胞中的自噬體-溶酶體的融合

自噬體與溶酶體的融合是自噬降解的一個(gè)基本過程，研究發(fā)現(xiàn)在Cal27和HN6細(xì)胞中，自噬體標(biāo)記物GFP-LC3和溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP2的共定位比例不受NUPR1敲低的影響（圖6）。

7. NUPR1的敲低抑制了OSCC細(xì)胞中溶酶體的功能

為了研究NUPR1的敲低是否抑制了溶酶體的功能，作者檢測了溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1和LAMP2的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在Cal27和HN6細(xì)胞中，NUPR1的敲低抑制了LAMP1的表達(dá)，但不抑制LAMP2 (圖7e和7f)。此外，在NUPR1敲低的OSCC細(xì)胞中，溶酶體蛋白水解活性明顯受到抑制(圖7g)、溶酶體綠色熒光探針的熒光強(qiáng)度也顯著降低（圖7h）。綜上所述NUPR1敲低對自噬流的阻斷可能是通過抑制OSCC細(xì)胞內(nèi)溶酶體功能來介導(dǎo)的。

8. TFE3負(fù)責(zé)OSCC細(xì)胞中NUPR1介導(dǎo)的自噬溶酶體過程

為了闡明NUPR1影響自噬溶酶體的潛在機(jī)制，作者使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析NUPR1敲低的Cal27細(xì)胞和對照組的顯著差異蛋白，結(jié)果表明NUPR1的敲低顯著降低了TFE3的表達(dá)水平，western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果（圖8a和8b），PCR實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了自噬流中涉及的“TFE3應(yīng)答基因”的表達(dá)變化（圖8c和8d），綜上表明NUPR1在自噬溶酶體事件中發(fā)揮的關(guān)鍵作用可能與TFE3有關(guān)。

已知NUPR1是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要轉(zhuǎn)錄因子，故作者采用熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測NUPR1與TFE3的關(guān)系，結(jié)果表明在OSCC進(jìn)展中，NUPR1是通過增加TFE3啟動(dòng)子活性和激活TFE3轉(zhuǎn)錄來維持自噬流的（圖8e和8f）。

此外， TFE3的過表達(dá)可以顯著挽救NUPR1敲低對Cal27和HN6細(xì)胞溶酶體功能的損傷（圖9a-9d）,也顯著降低了NUPR1缺失的OSCC細(xì)胞中MAP1LC3B-II和SQSTM1的積累(圖9e和9f)。

9. 在體外和體內(nèi)，NUPR1通過激活TFE3依賴的自噬促進(jìn)OSCC的進(jìn)展

為了探究TFE3在NUPR1敲低介導(dǎo)的OSCC細(xì)胞進(jìn)展中的影響，作者展開了一系列的體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明TFE3的過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了NUPR1 敲低介導(dǎo)的OSCC細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用(圖10a-f)。

此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NUPR1敲低導(dǎo)致接種于裸鼠皮下的Cal27細(xì)胞形成的腫瘤的體積和重量明顯減少（圖11a-11c）。也導(dǎo)致了轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)形成和生長的抑制（圖11d）。同時(shí)，NUPR1敲低有效地抑制了異種移植瘤模型中TFE3和“TFE3應(yīng)答基因”的表達(dá)(圖11e)。在對轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的評估中也得到了同樣的結(jié)果（圖11f）。綜上所述，NUPR1敲低對OSCC進(jìn)展的抑制依賴于TFE3活性的抑制。

小編小結(jié)

在本研究中，作者首次證明了(Ⅰ)通過對有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細(xì)胞癌 (OSCC)組織FFPE樣本的蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了NUPR1是一種關(guān)鍵蛋白，在LNM患者中顯著增強(qiáng)，且與OSCC轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈正相關(guān)。(Ⅱ)溶酶體功能障礙而非其他關(guān)鍵步驟的破壞(自噬體形成或成熟，自噬體-溶酶體融合)是NUPR1 敲低誘導(dǎo)的自噬流受損和OSCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移抑制的關(guān)鍵原因。(Ⅲ)在OSCC進(jìn)展中，NUPR1通過增加TFE3啟動(dòng)子活性和激活TFE3轉(zhuǎn)錄來維持自噬流。這些發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞癌進(jìn)展中NUPR1-TFE3依賴的自噬的潛在治療靶點(diǎn)拓寬了新的見解。