circRNAs是一類單鏈環(huán)狀的非編碼RNA，在病毒、植物和哺乳動(dòng)物等各物種中廣泛表達(dá)。區(qū)別于傳統(tǒng)的線性RNA，circRNA不具有5‘帽子結(jié)構(gòu)和3‘ poly(A)尾，并以共價(jià)鍵的形式閉合成環(huán)，對(duì)核酸外切酶不敏感，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了circRNA高度的穩(wěn)定性。

起初發(fā)現(xiàn)的少量circRNA，被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄剪切過(guò)程中因剪接錯(cuò)誤產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物，不確定在生物學(xué)過(guò)程中是否發(fā)揮重要作用。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在大量的circRNA。直到2013年，Nature雜志的兩篇研究論文取得了突破性研究進(jìn)展，首次證明circRNA可以通過(guò)充當(dāng)miRNA海綿，參與基因表達(dá)調(diào)控而發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而迅速成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。我們本期將從circRNA分類及成環(huán)機(jī)制、circRNA生物學(xué)功能、circRNA常規(guī)研究思路及方法和常用數(shù)據(jù)庫(kù)等方面帶大家具體了解一下circRNA的“神秘”。

circRNA分類及成環(huán)機(jī)制

RNA的選擇性剪接是真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程的重要事件。mRNA前體經(jīng)過(guò)剪接后將內(nèi)含子去除，使外顯子依次連接或跳躍式連接產(chǎn)生成熟的mRNA。CircRNA是mRNA前體經(jīng)反向剪接產(chǎn)生，由下游剪接受體與上游剪接供體連接形成共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，主要可產(chǎn)生三種類型的circRNA：

圖1.?circRNA成環(huán)機(jī)制示意圖[1]

（BP：branch point，分支點(diǎn)；SA：splice-acceptor，剪接受體；SD：splice-donor，剪接供體；BSJ：backsplice junction，反向連接點(diǎn)）

1.由外顯子構(gòu)成的circRNA（exonic circRNA，EcircRNA）

目前研究認(rèn)為EcircRNA有兩種形成方式：套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化，內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化。

①?套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化：這種環(huán)化方式是mRNA前體首先經(jīng)過(guò)經(jīng)典剪接作用和外顯子跳讀，生成具有多個(gè)外顯子且包含內(nèi)含子套索的線性RNA，然后經(jīng)反向剪接，即內(nèi)含子套索下游3’端的剪接受體與上游5’端的剪接供體連接成環(huán)，并將內(nèi)含子切除后形成成熟的circRNA。

②?內(nèi)含子驅(qū)動(dòng)環(huán)化：內(nèi)含子驅(qū)動(dòng)環(huán)化也有兩種方式。一是依賴外顯子兩端的內(nèi)含子中具有一定長(zhǎng)度的互補(bǔ)序列，經(jīng)互補(bǔ)配對(duì)后，拉近了兩端的剪接受體和剪接供體，此時(shí)內(nèi)含子被切除，脫落的外顯子連接成環(huán)；這是促進(jìn)外顯子環(huán)化的有效方法，短散在重復(fù)序列（SINE）家族成員Alu元件已明確是可促進(jìn)circRNA成環(huán)，且已作為成環(huán)元件廣泛應(yīng)用于外源性表達(dá)circRNA。二是通過(guò)RNA結(jié)合蛋白（RBP）驅(qū)動(dòng)環(huán)化，當(dāng)外顯子兩端的內(nèi)含子序列具有RBP結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，RBP與之結(jié)合后形成二聚體，使兩個(gè)剪接位點(diǎn)靠近，從而促進(jìn)環(huán)化。

2.由內(nèi)含子構(gòu)成的circRNA（intronic?circRNA，ciRNA）

ciRNA的形成過(guò)程與EcircRNA不同。正常情況下，經(jīng)典剪接過(guò)程中釋放的內(nèi)含子套索會(huì)被降解；然而當(dāng)其5’端剪接位點(diǎn)包含一段7nt富含GU堿基的序列以及3’端附近含有11nt富含C堿基的序列，使內(nèi)含子套索受到保護(hù)，即會(huì)形成ciRNA。

3.外顯子和內(nèi)含子組合形成的circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）

事實(shí)上，套索驅(qū)動(dòng)和內(nèi)含子驅(qū)動(dòng)環(huán)化不僅可以產(chǎn)生EcircRNA，也可能會(huì)產(chǎn)生EIciRNA。

除此之外，tRNA和病毒RNA等也可環(huán)化產(chǎn)生circRNA。

circRNA生物學(xué)功能

從“垃圾”到明星分子，circRNA的功能得到不斷發(fā)掘，circRNA不僅具有調(diào)控功能，部分還有其獨(dú)特的翻譯能力，且廣泛參與機(jī)體的生理和病理機(jī)制。

圖2.?circRNA功能示意圖[2]

1.充當(dāng)miRNA海綿

起初觀察到一些circRNA有許多miRNA結(jié)合位點(diǎn)，后來(lái)大量研究證實(shí)了這一點(diǎn)。位于細(xì)胞質(zhì)中的circRNA可以充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA），吸附miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能。

2.circRNA翻譯功能

真核細(xì)胞中mRNA通過(guò)5’端帽子結(jié)構(gòu)附著到核糖體上，最終翻譯出多肽。circRNA缺乏5’帽子，無(wú)法依賴這種方式進(jìn)行啟動(dòng)翻譯，但是含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的circRNA可以直接募集核糖體并起始翻譯，此類circRNA需同時(shí)擁有開放閱讀框（ORF）且位于IRES下游。

3.轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能

circRNA可以通過(guò)與相應(yīng)DNA位點(diǎn)結(jié)合形成RNA－DNA雜交鏈或R環(huán)，導(dǎo)致結(jié)合處無(wú)法轉(zhuǎn)錄，發(fā)生外顯子跳躍或轉(zhuǎn)錄終止，進(jìn)而產(chǎn)生新的剪切體。另一方面，circRNA也可與轉(zhuǎn)錄因子相互作用以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。

4.circRNA與蛋白質(zhì)相互作用

除上述功能外，circRNA還可以與一種或多種蛋白相互作用，充當(dāng)?shù)鞍渍T餌、支架或募集劑。具體而言，circRNA與蛋白結(jié)合可能產(chǎn)生多方面的影響：

①?改變蛋白間或蛋白與核酸分子的相互作用：一種模式是circRNA同時(shí)與兩種蛋白相互作用，促進(jìn)或解離這兩種蛋白的互作；另一種模式是circRNA通過(guò)與一種蛋白相互作用，來(lái)影響該蛋白與另一蛋白的互作；還有一種則是circRNA只與一種蛋白結(jié)合，使其功能喪失或產(chǎn)生新的功能。

②?募集蛋白到染色質(zhì)中：circRNA與順式作用元件結(jié)合并招募轉(zhuǎn)錄因子或表觀遺傳修飾酶等，進(jìn)而改變基因表達(dá)。

③?改變蛋白的核內(nèi)外分布：核定位或胞質(zhì)中可入核的circRNA可促進(jìn)蛋白的核易位，胞質(zhì)定位或核內(nèi)可輸出到胞質(zhì)中的circRNA則促進(jìn)蛋白的胞質(zhì)易位；此外還有部分可轉(zhuǎn)運(yùn)至膜或線粒體等。

circRNA常規(guī)研究思路及方法

從上一小節(jié)可知，目前發(fā)現(xiàn)circRNA發(fā)揮作用的功能機(jī)制分類繁雜，其中以ceRNA相關(guān)機(jī)制研究為主。這里總結(jié)了circRNA的一般研究思路尤其是ceRNA機(jī)制，以及對(duì)應(yīng)的一些研究方法，供大家參考（圖3）。

值得注意的是，與普通線性基因不同，circRNA的表達(dá)調(diào)控有其特別之處。

（1）circRNA過(guò)表達(dá)：內(nèi)源性circRNA之所以能閉合成環(huán)，是因?yàn)閏ircRNA序列外顯子兩側(cè)的長(zhǎng)側(cè)翼內(nèi)含子具有成環(huán)元件（如Alu），能夠促進(jìn)線性序列成環(huán)。因此使用質(zhì)粒或病毒載體進(jìn)行外源性表達(dá)，同樣需要在circRNA序列兩端加上成環(huán)元件，以確保序列成環(huán)。

（PS：漢恒生物circRNA成環(huán)載體系統(tǒng)可達(dá)到100%成環(huán)哦，且體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均適用。）

（2）circRNA干擾：siRNA或shRNA即可用于敲低circRNA，但為避免干擾到其母本基因或線性序列的表達(dá)，需針對(duì)circRNA的接點(diǎn)處設(shè)計(jì)干擾靶點(diǎn)。

（3）circRNA敲除：使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除circRNA?？紤]可能會(huì)影響到親本基因的表達(dá)，一般是不會(huì)直接敲除circRNA的片段。通常采取敲除circRNA的成環(huán)元件Alu的方式，破環(huán)其成環(huán)能力，即針對(duì)circRNA兩端長(zhǎng)側(cè)翼內(nèi)含子中的Alu序列設(shè)計(jì)雙gRNA進(jìn)行敲除，此法難點(diǎn)在于內(nèi)含子中可能存在不止一個(gè)Alu元件，需從中找出催化成環(huán)對(duì)應(yīng)的序列。

圖3.?circRNA研究思路及相關(guān)方法

本期內(nèi)容從circRNA的分類、成環(huán)機(jī)制、主要生物學(xué)功能、研究思路及方法這幾個(gè)方面進(jìn)行了具體介紹，希望能幫助到想入門研究circRNA或涉及相關(guān)研究方向的小伙伴，有興趣可以根據(jù)這些知識(shí)點(diǎn)深入拓展哦~另外，漢恒生物可以提供circRNA過(guò)表達(dá)、干擾和敲除載體的構(gòu)建、與靶基因互作的雙熒光素酶驗(yàn)證服務(wù)等，并擁有專業(yè)的技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)為您答疑解惑，有意向的小伙伴歡迎與我們聯(lián)系~下期我們將繼續(xù)介紹另一種重要的非編碼RNA—microRNA，敬請(qǐng)關(guān)注！

參考文獻(xiàn)：

[1] Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019 Nov;20(11):675-691. doi: 10.1038/s41576-019-0158-7.

[2] Li R, Jiang J, Shi H, Qian H, Zhang X, Xu W. CircRNA: a rising star in gastric cancer. Cell Mol Life Sci. 2020 May;77(9):1661-1680. doi: 10.1007/s00018-019-03345-5.