1952年，Henrietta Lack（HeLa）細(xì)胞成為第一個(gè)可以在實(shí)驗(yàn)室中無(wú)限傳代的人類細(xì)胞系，而這些細(xì)胞被科學(xué)家們標(biāo)記為“永生的”。研究人員最初是從侵襲性宮頸癌腫瘤中提取出的HeLa細(xì)胞。這些細(xì)胞在不斷供應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)下持續(xù)繁殖，并在不到24小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)出新一代的細(xì)胞。與許多腫瘤一樣，Hela細(xì)胞具有錯(cuò)誤組成的基因組，其中多個(gè)染色體有一個(gè)或多個(gè)拷貝：正常細(xì)胞有46條染色體，而Hela細(xì)胞包含76至80條染色體，其中一些染色體嚴(yán)重突變。同時(shí)，這些細(xì)胞還表達(dá)了過(guò)反應(yīng)性端粒酶，即每次分裂后重建端粒，防止細(xì)胞衰老，以允許HeLa細(xì)胞無(wú)限傳代。

HeLa細(xì)胞系為許多醫(yī)學(xué)突破都做出了貢獻(xiàn)，從研究太空零重力效應(yīng)和脊髓灰質(zhì)炎疫苗的開(kāi)發(fā)，到白血病、艾滋病病毒和癌癥的全球性研究。盡管現(xiàn)在有許多其他細(xì)胞系也在使用，但自HeLa細(xì)胞被分離以來(lái)，HeLa細(xì)胞在當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的大多數(shù)領(lǐng)域都取得了一定的進(jìn)展，尤其是在癌癥生物學(xué)，傳染病，基礎(chǔ)微生物學(xué)等領(lǐng)域都取得了一些重大進(jìn)展。涉及HeLa細(xì)胞的研究已經(jīng)在超過(guò)11000份科學(xué)刊物中描述過(guò)，其中包括三份獲得過(guò)諾貝爾獎(jiǎng)的：2008年發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌的致病因子；2009年發(fā)現(xiàn)端粒酶可以保護(hù)染色體的端粒，從而防止染色體的降解，和2014年促進(jìn)在細(xì)胞生長(zhǎng)方面的實(shí)時(shí)觀察。這個(gè)驚人的數(shù)字清晰地表明這些細(xì)胞在過(guò)去六十年中對(duì)研究的重要性。

HeLa細(xì)胞的多功能性和強(qiáng)大功能使其成為必不可少的實(shí)驗(yàn)室工具，繼續(xù)為人類健康與疾病的基礎(chǔ)提供新的線索。HeLa細(xì)胞是熱門(mén)的細(xì)胞模型之一，也是生命科學(xué)家的工具，去研究疾病或治療活性藥物分子的作用機(jī)制，以及破譯細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，如DNA損傷修復(fù)。研究人員選擇HeLa細(xì)胞作為多學(xué)科研究的工具，因?yàn)樗哂杏郎募?xì)胞特征，可適用于多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，和轉(zhuǎn)錄組學(xué)），并且易于利用這些數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)設(shè)計(jì)和改進(jìn)研究項(xiàng)目。最近的一項(xiàng)研究就是利用HeLa細(xì)胞研究SARS-CoV-2病毒在人體中的感染性。研究COVD-19的科學(xué)家們使用HeLa細(xì)胞以確定病毒用于進(jìn)入人體細(xì)胞的受體。基于對(duì)HeLa細(xì)胞的研究，新型冠狀病毒的研究取得了前所未有的進(jìn)展。

應(yīng)用范圍：

HeLa細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展成為研究各種課題的有用模型。源自HPV轉(zhuǎn)化的宮頸腺癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞已被用于各種研究，包括但不限于癌癥的研究。作為一種腫瘤模型，它們已被廣泛應(yīng)用于研究中：

1. 腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

2. 藥物開(kāi)發(fā)

3. 細(xì)胞死亡途徑

CRISPR-U? 基因編輯在HeLa細(xì)胞的應(yīng)用

CRISPRCRISPR-Cas系統(tǒng)已經(jīng)成為了革命性的基因組編輯工具，為生命科學(xué)的發(fā)展和我們對(duì)生命的理解提供了巨大的動(dòng)力。CRISPR系統(tǒng)用于精確的基因組編輯，可以通過(guò)用所需的供體序列取代靶基因序列來(lái)進(jìn)行基因敲除或敲入基因組的操作。

HeLa細(xì)胞是一種侵襲性宮頸癌細(xì)胞系。在HeLa細(xì)胞系中進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)基因敲除，正確的突變或插入報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因。這些經(jīng)過(guò)基因組編輯的HeLa細(xì)胞系將提供給研究人員用于研究癌癥，癌癥治療，細(xì)胞死亡，功能基因組學(xué)，信號(hào)通路，藥物研發(fā)，藥物反應(yīng)和細(xì)胞治療。

圖：針對(duì)工程ESC和iPSC的CRISPR-U?定制流程

源井生物自主研發(fā)的CRISPR-U?可用于HeLa細(xì)胞系的基因操作。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因組編輯。源井生物可以定制真核HeLa細(xì)胞中的基因編輯，也可以在動(dòng)物模型中進(jìn)行各種基因改造。

源井生物自主研發(fā)的?CRISPR-U??技術(shù)優(yōu)化了真核細(xì)胞和動(dòng)物基因編輯載體和過(guò)程。效率和準(zhǔn)確度比傳統(tǒng)方法提高了10倍。馬上聯(lián)系我們，了解與您研究相關(guān)的服務(wù)吧！

基因敲除Hela的研究案例：

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的TERT的紊亂可抑制腫瘤細(xì)胞的存活

端粒是真核細(xì)胞中維持染色體完整性的一種獨(dú)特結(jié)構(gòu)。哺乳動(dòng)物的端粒長(zhǎng)度主要受端粒酶的調(diào)控，而端粒酶是一種核糖核蛋白，由逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）和RNA亞基（TERC）組成。TERC在所有細(xì)胞中都有組成性表達(dá)，而TERT的表達(dá)則是在大多數(shù)成年體細(xì)胞中受到時(shí)間和空間上的調(diào)控。在體細(xì)胞中，TERT被滅活，因此端粒酶活性不會(huì)被檢測(cè)到。而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞通過(guò)激活TERT的機(jī)制來(lái)阻止進(jìn)行性端粒侵蝕以實(shí)現(xiàn)增殖永生。因此，TERT失活被認(rèn)為是一種很有前景的腫瘤治療手段，研究人員利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)來(lái)靶向癌細(xì)胞中的TERT基因。為此，他們選擇了三種不同的癌細(xì)胞系：宮頸癌細(xì)胞系（HeLa）、胰腺癌細(xì)胞系（PANC1）和乳腺癌細(xì)胞系（SUM159），并設(shè)計(jì)了三個(gè)分別針對(duì)人類TERT基因外顯子2（E2）、外顯子4（E4）和外顯子6（E6）的gRNAs（sg1、sg2和sg3）。研究人員進(jìn)一步設(shè)計(jì)了另外兩個(gè)靶向TERT外顯子4（E4）側(cè)翼內(nèi)含子的gRNAs（sg4和sg5）來(lái)產(chǎn)生KO-TERT細(xì)胞。在單倍劑量不足的研究中，突變的TERT細(xì)胞端粒酶活性降低，端粒變短。與WTPE-Hela細(xì)胞相比，細(xì)胞增值測(cè)量、細(xì)胞培養(yǎng)密度和更強(qiáng)的β-gal染色信號(hào)都顯示出突變的TERT細(xì)胞產(chǎn)生了嚴(yán)重的細(xì)胞衰老。Annexin V和PI染色也提供了細(xì)胞凋亡的證據(jù)：突變的TERT細(xì)胞比WTPE-Hela細(xì)胞具有更高的凋亡率；在體外腫瘤細(xì)胞中缺乏TERT單鏈則導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)遲緩和加速死亡。

圖1：Tert+/-癌細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩，細(xì)胞加速死亡。（A） WT和TERT+/-Hela細(xì)胞的群體倍增時(shí)間。（B） 第2代（P2）、P5和P7代WT和TERT+/-Hela細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡圖像。（C）WT和TERT+/-Hela細(xì)胞的β-gal染色。箭頭指示嚴(yán)重衰老細(xì)胞的例子。（D）LDH法測(cè)定WT和TERT+/-Hela細(xì)胞的細(xì)胞死亡率。（E）流式細(xì)胞術(shù)定量分析annexin-V和碘化丙啶（PI）染色對(duì)WT和TERT+/-Hela細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。**p<0.01。

研究人員進(jìn)一步利用腫瘤異種移植的裸鼠模型研究了TERT單倍劑量不足對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率的影響，并在接種后6周檢查異種移植物的大小。正如預(yù)期，WTPE-Hela細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)成直徑約2cm的腫瘤塊，而TERT突變的Hela細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)未能形成任何的腫瘤塊，這一結(jié)果證明了Cas9介導(dǎo)的TERT單倍劑量不足可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖2：WT和TERT+/-Hela細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的異種移植

基因點(diǎn)突變Hela的研究案例：

利用CRISPR/Cas9引入致病性MSH2點(diǎn)突變導(dǎo)致人類細(xì)胞差異性基因組的失穩(wěn)

重復(fù)去穩(wěn)定化與人類疾病有多種關(guān)聯(lián)，特別是在腫瘤性疾病中。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）被認(rèn)為是簡(jiǎn)單反映了DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）缺陷。而MSI+表型在各種人類腫瘤中并不相同。根據(jù)微衛(wèi)星變化的頻率，MSI分為MSI-H（高）和MSI-L（低）。此外，MSI還對(duì)其不同的定性模式進(jìn)行了分類，如A型和B型。早前的一項(xiàng)研究表明，MMR基因敲除小鼠中的腫瘤并未表現(xiàn)出MSI-H腫瘤中典型的劇烈微衛(wèi)星變化（即B型），而是小而細(xì)微的改變（即A型）。

林奇綜合征（LS）被稱為遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC），是遺傳性結(jié)直腸癌（結(jié)腸癌）的最常見(jiàn)原因。MLHL，MSH2，MSH6，PMS2和EPCAM這些基因的突變是造成林奇綜合征的因素。在這項(xiàng)研究中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將林奇綜合征（LS）中的MSH2突變引入到HeLa細(xì)胞中。研究人員使用基因組編輯載體pSpCas9（BB）-2A-Puro（pX459），gRNA（由CRISPR-direct和CRISPR設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)）并使用BbsI位點(diǎn)亞克隆到pX459中。使用Lipofectamine 2000將編碼gRNA的pX459質(zhì)粒和三種不同的單鏈ssODN共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。產(chǎn)生的突變克隆清楚地表現(xiàn)出具有烷化劑耐受性和突變頻率升高的MMR缺陷表型。然而，微衛(wèi)星并沒(méi)有像MSI-H腫瘤在林奇綜合征患者中表現(xiàn)得那么顯著地不穩(wěn)定，且所有觀察到的變化均為A型，而這恰恰證實(shí)了小鼠的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明人類基因組中重復(fù)不穩(wěn)定的分子機(jī)制是更加復(fù)雜的。

圖：CRISPR/Cas9系統(tǒng)將MSH2 G674突變引入HeLa細(xì)胞。（A） 人MSH2蛋白中的功能區(qū)域，包括Walker A基序，（B）每個(gè)G674突變體版本中Walker A基序中的局部DNA和氨基酸序列，（C）用于實(shí)驗(yàn)的向?qū)NA和ssODN的結(jié)構(gòu)。（D）Sanger方法確認(rèn)每個(gè)已建立的HeLa克隆。

這項(xiàng)研究已成功獲取了MSH2突變的HeLa克隆，并且這些已建立的克隆明顯表現(xiàn)出具有烷化劑耐受性和升高的突變頻率的MMR缺陷表型。盡管在這些克隆中，微衛(wèi)星并未像林奇綜合征患者中的腫瘤那樣表現(xiàn)出明顯不穩(wěn)定。目前的發(fā)現(xiàn)表明，除了MMR缺陷外，以前無(wú)法識(shí)別出的分子機(jī)制可能是人類細(xì)胞重復(fù)失穩(wěn)的根本。

基因敲入Hela的研究案例：

sgRNA的可逆遮蓋/揭開(kāi)策略（Cloaking/Uncloaking strategy）可控制CRISPR–Cas9在體外和活細(xì)胞中的基因編輯效率

RNA“遮蓋”（RNA Cloaking）是控制RNA雜交，折疊和酶促相互作用的溫和且可逆的一種化學(xué)方法。在這項(xiàng)研究中，研究人員使用疊氮化物取代的?；溥蛟噭∟AI-N3）在合成后?；疪NA的20-OH基團(tuán)，導(dǎo)致RNA折疊，雜交和功能的阻斷。使用水溶性磷化氫處理后，此類聚?；ā罢谏w”）RNA的體外活性可被有效修復(fù)，這種水溶性磷化氫引起疊氮化物的施陶丁格還原反應(yīng)，然后自發(fā)地失去?；ā敖议_(kāi)”）。研究人員用sgRNAs研究這些可逆的遮蓋/揭開(kāi)現(xiàn)象，來(lái)調(diào)控CRISPR-Cas9系統(tǒng)在體外和活細(xì)胞中的基因編輯效率。

對(duì)于體外研究，研究人員設(shè)計(jì)了一種體外基因編輯模型平臺(tái)，該平臺(tái)具有103個(gè)核苷酸長(zhǎng)（nt）的合成sgRNA，是以Cy5標(biāo)記的雙鏈DNA（dsDNA）為靶點(diǎn)并編碼一部分的綠色熒光蛋白（GFP）。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)被“遮蓋”的sgRNA與三羥丙基膦（THPP）或二苯基膦苯-3-磺酸鹽（TPPMS）在濃度為1-5

mM的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）緩沖液中于37℃培養(yǎng)1小時(shí)時(shí)，得到了最高程度的Cas9介導(dǎo)的DNA切割——表現(xiàn)為在定量層面上活性被完全恢復(fù)到未處理sgRNA的水平。這種驚人的體外表現(xiàn)表明了該方法在CRISPR-Cas9診斷應(yīng)用中的控制時(shí)機(jī)和啟動(dòng)方面是有潛在用途的。

對(duì)于體內(nèi)研究，研究人員使用了GFP陽(yáng)性的HeLa細(xì)胞，而這些細(xì)胞最初是通過(guò)核轉(zhuǎn)染或商用陽(yáng)離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染GFP靶向sgRNA和Cas9蛋白。他們進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，基于與體外實(shí)驗(yàn)相同的步驟，用來(lái)測(cè)試“遮蓋”由CART遞送的GFP靶向sgRNA是否能夠阻斷在GFP陽(yáng)性HeLa細(xì)胞中CRISPR–Cas9的基因組編輯。他們觀察到用“遮蓋”的sgRNA/Cas9 mRNA轉(zhuǎn)染的GFP陽(yáng)性細(xì)胞與未處理的細(xì)胞有著相同的GFP熒光表達(dá)水平。這證實(shí)了sgRNA的?；旧献钄嗔嘶罴?xì)胞中的所有sgRNA的活性。因此，該研究強(qiáng)調(diào)了可逆RNA酰化可作為一種新的方法來(lái)控制基因組編輯的功能。

圖1：（a）NAI-N3抑制CRISPR-Cas9基因編輯的機(jī)制。sgRNA的“遮蓋”是通過(guò)Cas9核酸酶抑制RNA引導(dǎo)的DNA雙鏈切割（b）使用Cy5標(biāo)記的dsDNA和未處理的，“遮蓋”的和“揭開(kāi)、未遮蓋”的（磷化氫處理的）sgRNA在體外的Cas9核酸酶測(cè)定的PAGE分析。（c）條形圖表示gRNA與Cas9s培養(yǎng)后的DNA裂解分?jǐn)?shù)。

圖2：磷化氫控制人類細(xì)胞中被“遮蓋”的CRISPR–Cas9活性。（a） GFP陽(yáng)性HeLa細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析顯示，被“遮蓋”的sgRNA活性喪失，并通過(guò)磷化氫處理修復(fù)編輯；（b）圖表（數(shù)據(jù)來(lái)自流式細(xì)胞儀）顯示未處理的，“遮蓋”的和磷化氫處理的sgRNA的基因編輯效率（c）熒光顯微鏡圖像顯示用未處理的sgRNA和Cas9 mRNA轉(zhuǎn)染后的GFP敲除，被“遮蓋”的sgRNA失去編輯的作用，使GFP熒光不受影響，以及用磷化氫處理后細(xì)胞的編輯作用恢復(fù)。

參考文獻(xiàn):

CRISPR/Cas9-Mediated TERT Disruption in Cancer Cells. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 653. Differential genomic de-stabilization in human cells with pathogenic MSH2 mutations introduced by genome editing. Experimental Cell Research, 2019 (377) 24–35.

Reversible RNA acylation for control of CRISPR-Cas9 gene editing. Chem. Sci.,

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