熒光染料的定義：

熒光染料（也稱為熒光團/活性染料）可以簡單地描述為分子（本質(zhì)上是非蛋白質(zhì)），在顯微鏡下，通過吸收給定波長的光并以更長的波長重新發(fā)射光來實現(xiàn)其功能。 這種熒光產(chǎn)生不同的顏色，可以可視化和分析。

熒光染料通常用于各種生物分子（抗體、肽、各種蛋白質(zhì)等）的熒光標(biāo)記，用于監(jiān)測藥物向目標(biāo)組織的輸送、成像等過程。

熒光染料分類：

※ 有機熒光染料

※ 生物熒光基團

一、有機熒光染料

? ? ? 本質(zhì)上，有機染料的特征在于源自在整個生色團上離域的光學(xué)躍遷或源自分子間電荷轉(zhuǎn)移躍遷（從激發(fā)電子態(tài)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移）的發(fā)射。

? ? ? 在這里，表現(xiàn)出源自在整個生色團上離域的光學(xué)躍遷的發(fā)射的染料被稱為共振染料（介觀染料），而后者被稱為 CT 染料（電荷轉(zhuǎn)移染料）?；ㄇ?、羅丹明和熒光素是一些最常見的共振染料，其特點是窄的吸收和發(fā)射帶（略微結(jié)構(gòu)化），往往相互鏡像，以及小的、對溶劑極性不敏感的斯托克斯位移。

? ? ?另一方面，CT 染料包括香豆素和丹磺酰熒光團等染料，其特點是與共振染料相比，吸收和發(fā)射帶結(jié)構(gòu)無結(jié)構(gòu)，分離良好，以及更大的斯托克斯位移。

? ? ?同樣，與共振染料相比，CT 染料具有更小的摩爾吸收系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。

※ 對于共振和 CT 熒光染料，在結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系眾所周知的情況下，可以通過精心設(shè)計的策略來微調(diào)光譜性質(zhì)。

1.有機熒光染料的種類:

a. 熒光素

與花青和羅丹明染料一樣，熒光素也是一種有機染料。熒光素的最大吸收波長為 494nm，最大發(fā)射波長為 521nm（通常吸收藍色范圍內(nèi)的光并發(fā)射綠色范圍內(nèi)的光），熒光素是一種高熒光物質(zhì)。 即使在非常少量的情況下也可以檢測到它，并且在與抗體結(jié)合時用于顯微鏡檢查。

熒光素的衍生物包括異硫氰酸熒光素、俄勒岡綠和羧基萘并熒光素等。 與許多其他熒光染料一樣，熒光素價格低廉且易于使用，使其成為生物學(xué)研究中最受歡迎的染料之一。

與大多數(shù)其他染料不同，熒光素在水溶液中是無毒的。 因此，它是極少數(shù)用作地下水示蹤劑的染料之一。

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b. 異硫氰酸熒光素(FITC)

異硫氰酸熒光素是流式細胞術(shù)和免疫熒光中最常用的有機熒光染料/探針之一。 它的特點是最大/峰值吸光度為 495nm，發(fā)射波長為 520nm，熒光素與熒光素之間的相互作用導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移和濃縮時的自猝滅。

異硫氰酸熒光素染料標(biāo)記分子應(yīng)用：

(a)電泳分離后的蛋白質(zhì)檢測

(b)蛋白質(zhì)和肽的微測序分析

(c)使用毛細管區(qū)帶電泳進行分子分析

(d)生物相互作用中的分子跟蹤和檢測

(e)細胞和組織切片中的抗原檢測

(f)通過標(biāo)記 DNA 片段進行細胞凋亡檢測

除了因其在水中的溶解性而易于用于偶聯(lián)物制備外，異硫氰酸熒光素還具有明亮的熒光（由于偶聯(lián)后的大消光系數(shù)和高量子產(chǎn)率），使其成為許多工藝的首選染料。

※ 在流式細胞術(shù)和免疫熒光顯微術(shù)中，染料與各種抗體（一抗或二抗）結(jié)合，以檢查和研究IL-17免疫缺陷和CD63在腎功能中的作用等狀態(tài)。

※ 作為熒光素的衍生物，異硫氰酸熒光素含有一個異硫氰酸酯反應(yīng)基團，這有助于其對通常存在于生物分子中的動漫和巰基基團具有反應(yīng)性。

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※ 流式細胞術(shù)簡介

免疫熒光顯微術(shù)涉及在顯微鏡下觀察化學(xué)標(biāo)記的分子，而流式細胞術(shù)涉及在流式細胞儀中檢測和測量此類分子的特征。

在流式細胞術(shù)方法中，來自給定培養(yǎng)物/組織樣品的細胞懸液（單細胞懸液）在微量滴定器中與熒光團標(biāo)記的抗體一起孵育，然后在流式細胞儀中進行分析。

在流式細胞儀中，使用鞘液聚焦懸浮液，使其細胞一次一個地通過激光束。 然后檢測發(fā)射的光（來自標(biāo)記細胞的熒光）用于分析。

c. 花青熒光染料

花青類熒光染料屬于共振染料，其特征在于具有離域電荷的氮原子（兩個氮原子）之間的聚甲炔染料。 由于與生物分子的低非特異性結(jié)合以及明亮的熒光，花青類熒光染料已成為一些最流行的用于標(biāo)記核酸的熒光染料。

花青類染料分為兩大類：

※ 非磺化花青類染料- 該組中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。 在大多數(shù)情況下，這些染料的特點是水溶性低，但胺的鹽酸鹽和酰肼除外。

它們首先溶解在有機溶劑（共溶劑）中，然后在生物分子標(biāo)記期間添加到含有生物分子的溶液中。

而“Cy”代表花青，第一個數(shù)字代表存在于亞油啉基團之間的碳原子數(shù)。 另一方面，添加 0.5 后綴以表示苯并稠合花青。 這些熒光染料通常用于有機介質(zhì)。

※ 磺化類花青染料- 該組由磺基-Cy3、磺基-Cy5 和磺基-Cy7 組成。 顧名思義，這些花青的特征是一個磺基，它有助于染料分子在水相中的溶解。

與非磺化花青相比，這些花青更易溶于水，因此不需要溶解在有機溶劑中進行標(biāo)記。 磺化花青通常用于標(biāo)記疏水性蛋白質(zhì)、水溶液中的納米顆粒以及可能被 DMSO 或 DMF 變性的敏感蛋白質(zhì)。

※ 兩組染料均可用于標(biāo)記以下生物分子：

肽、寡核苷酸和 DNA、抗體、可溶性蛋白質(zhì)。

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d.羅丹明熒光染料

與 曙紅(Eosin) 和 熒光素一起，羅丹明屬于呫噸族。 與市場上的許多其他染料相比，羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性，使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。

它們在聚合物納米粒子表面的表征、聚合物-生物偶聯(lián)物的檢測、活細胞的成像以及寡核苷酸在膠乳上的吸附分析等方面特別有用。

羅丹明熒光染料的衍生物也用作：

分子開關(guān)，病毒表面修飾，化學(xué)傳感器，硫醇。

不同類型的染料通過它們各自的取代基（R1、R2、R3、R4 和 G）來區(qū)分。 由于它們的差異，這些熒光染料在溶液中也表現(xiàn)出不同的光物理特性（例如不同的熒光壽命和發(fā)射最大值）。

氨基被剛性化的羅丹明染料無論溫度范圍如何都表現(xiàn)出高量子產(chǎn)率，而在每個氮處具有兩個烷基取代基的那些表現(xiàn)出活化的內(nèi)部轉(zhuǎn)化，量子產(chǎn)率和熒光壽命隨溫度的變化而變化。

※ 羅丹明 101 和羅丹明 B 是一些最常用的羅丹明染料，具有以下特點：

--羧基傾向于在酸性溶液中質(zhì)子化

--染料轉(zhuǎn)化為兩性離子堿性溶液

--兩性離子染料在極性較小的有機溶劑中變?yōu)闊o色內(nèi)酯

* 要將羅丹明用作熒光探針，必須對其進行修改。 這可以通過(the xanthene moiety)氨基、羧基苯基環(huán)或羧酸基團的修飾來實現(xiàn)。

* 與 TRITC 一樣，羅丹明 (NHS-rhodamine) 的 熒光特性為 544nm（最大吸收波長）和 576nm（最大發(fā)射）。

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二、生物熒光基團

在 1990 年代首次使用的綠色熒光蛋白（從水母維多利亞水母克隆）及其衍生物（例如藻紅藍蛋白、藻膽蛋白和藻紅蛋白等）是當(dāng)今生物學(xué)研究中最常用的一些生物熒光團。

雖然熒光團可用于在細胞、細菌和各種器官中表達質(zhì)粒，但它們的使用有一些缺點，即它可能很耗時，并且在融合時還能夠改變某些細胞蛋白的正常生物學(xué)功能。

此外，與許多其他熒光團相比，生物熒光團的光穩(wěn)定性和靈敏度較低。

1. 綠色熒光蛋白 (GFP)

綠色熒光蛋白是最流行的生物熒光團之一，由 238 個氨基酸組成，其中三個負責(zé)發(fā)出可見綠色熒光的結(jié)構(gòu)。 在水母本身中，熒光團與水母發(fā)光蛋白（一種蛋白質(zhì)）相互作用，當(dāng)添加鈣時會發(fā)出藍光。

通過 DNA 重組，研究人員可以使用負責(zé)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因來研究給定的基因和蛋白質(zhì)。 在這里，在將復(fù)合物插入細胞之前，該基因與另一個基因（負責(zé)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的第二個基因）結(jié)合。

如果細胞產(chǎn)生綠色熒光，研究人員就可以明顯看出該細胞能夠表達目標(biāo)基因。

* GFP 由 488nm 激光線激發(fā)，可在 510nm 處檢測。

* 來自熒光團的微弱信號可以使用抗 GFP 抗體放大。

作為生物標(biāo)記物，綠色熒光蛋白用于以下功能：

* 監(jiān)測各種生理過程

* 識別蛋白質(zhì)定位

* 檢測轉(zhuǎn)基因表達

2. 生物熒光團包括：

※ 藻紅蛋白- 藻紅蛋白 (PE) 是一種紅色蛋白色素復(fù)合物，屬于藻膽蛋白家族。 它可以在紅藻和隱植物中找到，它作為葉綠素色素的附屬物。

在生物科學(xué)中，熒光團可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，例如用于抗原檢測的抗體等，因為它能夠發(fā)出明亮的熒光。 由于熒光團往往會很快發(fā)生光漂白，因此很少在熒光顯微鏡中使用。 它經(jīng)常用于流式細胞術(shù)。

※ 別藻藍蛋白 (APC)- 與藻紅蛋白一樣，別藻藍蛋白也屬于藻膽蛋白家族，是從紅藻中分離出來的。 在 594 和 633 nm 的激光線激發(fā)下，熒光團的最大吸光度在 650 nm 處，而熒光發(fā)射峰在 66 nm 處。

與熒光素偶聯(lián)物相比，熒光團的靈敏度已顯示高 5 至 10 倍，并具有許多其他有益特性，包括大斯托克斯位移、高水溶性、長波長發(fā)射和耐猝滅。

雖然別藻藍蛋白通常不用于需要光穩(wěn)定性的應(yīng)用，但它廣泛用于流式細胞術(shù)、ELISA、微陣列等過程以及各種依賴高靈敏度的應(yīng)用。

3. 量子點

量子點開發(fā)于 1980 年代，是尺寸范圍在 2 到 50nm 之間的納米晶體（無機納米晶體）。根據(jù)大小，發(fā)出的光會從藍色變?yōu)榧t色（小的 QT 呈現(xiàn)藍光，而較大的 QT 呈現(xiàn)紅光）。

與當(dāng)今使用的其他一些熒光團相比，量子點具有很大的優(yōu)勢，因為可以通過控制粒徑、表面化學(xué)、分布以及組成材料來控制/調(diào)節(jié)它們的光學(xué)特性。

因此，它們適用于免疫標(biāo)記、多重生物檢測以及體外和體內(nèi)分析的分子成像等過程。

探針的主要特征之一是由于量子尺度效應(yīng)，它們具有寬的激發(fā)波長范圍以及窄的發(fā)射范圍。

通過利用這一特殊特性，可以在同一光源下激發(fā)多色量子點，實現(xiàn)對生物樣本中多個目標(biāo)的多路檢測和觀察。

a.量子點與其他熒光團不同的一些有益特性包括：

* 表現(xiàn)出 40% 至 90% 的高量子產(chǎn)率

* 非常高的熒光強度 - 這比羅丹明 6G11 分子亮約 20 倍

* 高度抗光漂白

* 探頭尺寸越大，發(fā)射波長越長

注意：量子點的主要缺點之一是發(fā)光間歇性（閃爍），這可能會影響分子檢測的某些過程。

為了將生物分子連接到量子點（生物共軛），使用了以下策略：

* 電子相互作用——使用表面活性劑（如巰基乙酸）來修飾量子點表面并提高溶解度。

* 共價連接 - 涉及使用諸如將分子的官能團（例如羧基和氨基官能團）連接到量子點表面的策略。

* 作為介質(zhì)的功能化微珠——可能涉及將量子點封裝到聚合物微珠中，這使得它們表面的官能團能夠與生物分子結(jié)合。

* 碳基量子點（例如石墨烯量子點）是新一代探針。 除了保留傳統(tǒng)量子點的許多優(yōu)點外，它們還被證明在生物共軛過程中表現(xiàn)出更有益的特性，而且細胞毒性很小。

4. 納米粒子

納米顆粒是指尺寸在 1 到 100 納米之間的顆粒。由于它們的小尺寸，納米粒子通常用于不同類型的細胞和組織的熒光成像。

當(dāng)今生物成像中常用的一些納米材料包括碳點、貴金屬納米顆粒、聚合物點、量子點和熒光摻雜二氧化硅等。

在成像中，與其他分子熒光團和探針相比，納米顆粒/納米材料具有多種優(yōu)勢，使其成為理想的選擇。除了提高亮度外，納米粒子是惰性的并且往往分布均勻，這有助于在成像過程中獲得更好的結(jié)果。

此外，與各種分子熒光團相比，納米顆粒和納米材料沒有細胞毒性，并且不受非特異性結(jié)合問題的影響。由于這些特性，大多數(shù)熒光納米顆粒（染色納米顆粒）可以內(nèi)化到細胞/組織中，并容易靶向給定部位。