抗體人源化

自單克隆抗體問世以來，最常用的鼠源性單克隆抗體在臨床診斷及治療等方面發(fā)揮了巨大的作用，但常用的鼠源單克隆抗體具有較強的免疫原性，在臨床應(yīng)用中會引起人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)， 導(dǎo)致抗體半衰期縮短（不到20 h），治療效果減弱。利用DNA重組和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對抗體基因進行重組，可在保留鼠源抗體對抗原有效結(jié)合部位的同時最大限度地降低非結(jié)合部位的鼠源性，這種通過重組基因表達的既有鼠源成分又有人源成分的抗體稱為人源化抗體，又可稱為基因工程抗體?？贵w人源化則成為了將鼠源性單抗轉(zhuǎn)化為安全有效的治療藥物的重要方式。

人源化抗體包括嵌合抗體、改型抗體、表面重塑抗體和全人源化抗體等幾類。

嵌合抗體

由于90%的HAMA是針對抗體C區(qū)的，設(shè)計從分泌鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞基因組中分離功能性Ig V區(qū)基因，然后與人Ｃ區(qū)基因按一定方式拼接，克隆到表達載體中并轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞所制備的抗體稱為嵌合抗體（Chimeric Antibody)。這種抗體的Fab區(qū)是鼠源的， Fc區(qū)是人源的。由于整個抗體分子約2/3 部分為人源的，較好地避免了HAMA反應(yīng)，延長了抗體在體內(nèi)的半衰期，改善了抗體藥物動力學(xué)。

1984年美國科學(xué)家Morrison等首次將人Ig的C區(qū)基因與鼠單克隆抗體的Ｖ區(qū)基因連接，成功表達人-鼠嵌合抗體以來，基因工程抗體的研究發(fā)展迅速。已有多種不同特異性的基因工程抗體經(jīng)FDA批準(zhǔn)進入臨床使用，顯示了良好的應(yīng)用前景。

改型抗體?

改型抗體也稱CDR植入抗體(CDR grafting antibody)，抗體可變區(qū)的CDR是抗體識別和結(jié)合抗原的區(qū)域，直接決定抗體的特異性。將鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，同時減少其異源性。然而，抗原雖然主要和抗體的CDR接觸，但FR區(qū)也常參與作用，影響CDR的空間構(gòu)型。因此換成人源FR區(qū)后，這種鼠源CDR和人源FR相嵌的V區(qū)，可能會改變單抗原有的CDR構(gòu)型，導(dǎo)致結(jié)合抗原的能力下降甚至明顯下降。雖然目前已能對抗體進行分子設(shè)計，在人源FR區(qū)引入鼠源FR區(qū)的某些關(guān)鍵殘基（如配置得當(dāng)，其親和力可與原有小鼠抗體的親和力相當(dāng)），但人源化抗體常達不到原有鼠源單抗的親和力。

表面重塑抗體

表面重塑抗體是指對異源抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換；另外，所替換的區(qū)段不應(yīng)過多，對于影響側(cè)鏈大小、電荷、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補決定區(qū)（CDR）構(gòu)象的殘基盡量不替換。

全人源化抗體

全人源化抗體是指通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達人類抗體，達到抗體全人源化的目的。

當(dāng)前正處于臨床研究的多種抗體中，嵌合抗體和人源化抗體所占比例大于70%。目前的人源化抗體，主要用于腫瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病的治療以及抗移植排斥反應(yīng)和抗病毒感染等方面。

通過完善的蛋白表達純化平臺，穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建平臺和噬菌體展示技術(shù)平臺，結(jié)合經(jīng)驗豐富的專家團隊（曾經(jīng)成功研制并且上市過治療性抗體藥物），普健生物可提供個性化方案定制，一對一項目跟進，細(xì)致化實驗報告等一站式抗體人源化服務(wù)，服務(wù)內(nèi)容包括以下幾個方面：

1

抗體可變區(qū)/抗體全長測序

通過鼠源單克隆抗體細(xì)胞系進行抗體可變區(qū)/抗體全長基因序列測序，2-4周。

2

嵌合抗體表達及抗原抗體結(jié)合分析

結(jié)合可變區(qū)序列及人源恒定區(qū)序列設(shè)計嵌合抗體，通過哺乳系統(tǒng)進行嵌合抗體表達；對嵌合抗體進行抗原抗體結(jié)合分析，同時可提供樣本給客戶進行親和力檢測及生物活性檢測，8~10周。

3

人源化抗體設(shè)計

基于CDR移植、回復(fù)突變、生物信息學(xué)分析等方法對VH和VL區(qū)域進行人源化設(shè)計，根據(jù)需求提供不同套餐供客戶選擇，2-3周。

敲黑板！

敲黑板！

我們知道

抗體人源化改造

的關(guān)鍵問題就在于

確定抗體FR區(qū)上對抗體親和力產(chǎn)生重大影響的

人源化替換位點，

換句話說就是定位影響CDR區(qū)構(gòu)象的關(guān)鍵氨基酸。

這決定了人源化抗體項目的成敗。

因此，必須高度重視

人源化抗體的設(shè)計。

否則，

很可能

“一失足成千古恨”

"再回頭資金已打水漂"。

也只有做好人源化抗體設(shè)計，

以下的步驟才有意義。

↓

4

人源化抗體表達

密碼子優(yōu)化，基因合成，亞克隆，轉(zhuǎn)染，抗體表達及純化，8-10周。

5

人源化抗體性質(zhì)檢測

結(jié)合力檢測：ELISA/FACS測定EC50值，或Biacore/Octet測定Kd值；人源化抗體體外生物活性分析并與嵌合抗體進行比較；人源化抗體與同源性物種的交叉反應(yīng)性分析；人源化抗體生物物理特性分析：SEC-HPLC分析，DS-PAGE分析，DSC分析。

普健生物人源化抗體的篩選

基于以下評估準(zhǔn)則：

• 哺乳細(xì)胞蛋白表達系統(tǒng)（HEK293F或CHO）進行瞬時表達的表達水平。

• 基于檢測指標(biāo)EC50（通過ELISA或FACS檢測）或Kd（通過Biacore或Octet檢測），將人源化抗體結(jié)合力與嵌合抗體結(jié)合力進行對比。

• 基于體外生物活性測試，將人源化抗體活性與嵌合抗體活性進行對比。

• 基于體外結(jié)合試驗，檢測人源化抗體與相關(guān)同源物種的交叉反應(yīng)性。

• 基于生物物理性質(zhì)分析，將人源化抗體與嵌合抗體進行對比，主要為以下幾點：

? ? ? a）通過SEC-HPLC鑒定大分子聚集程度。

? ? ? b）還原性及非還原性SDS-PAGE鑒定。

? ? ? c）通過DSC分析檢測Tm值。

更重要的是，

普健生物抗體人源化

方案制定是個性化的，

收費方式是分步的！

最后，

相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是鼠抗體人源化技術(shù)，抗體庫技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，以及對疾病機理的不斷深入研究，人源化抗體在臨床應(yīng)用中將會更加廣泛。