驗(yàn)證海星HyCyte?人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基對于人臍帶華通質(zhì)膠中提取間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的能力。人體臍帶橫截面示意圖，臍帶內(nèi)層覆蓋，外層為臍上皮，三個(gè)臍血管嵌在華通質(zhì)膠中。華通質(zhì)膠是一種凝膠狀結(jié)締組織，由富含糖胺聚糖（主要是透明質(zhì)酸）、膠原纖維和肌成纖維細(xì)胞以及偶爾存在的肥大細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)組成。華通質(zhì)膠基質(zhì)細(xì)胞在血管周圍附近最為豐富，在血管間華通質(zhì)膠中變少

二、實(shí)驗(yàn)試劑耗材

試劑：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（Cat.No.: UCHX-G101）?

其他配套試劑均為HyCyte?品牌
耗材：T175培養(yǎng)瓶

三、實(shí)驗(yàn)步驟

(1)用無菌輔料鑷從轉(zhuǎn)運(yùn)瓶中取出臍帶，置于1×PBS培養(yǎng)皿中。
(2)清洗臍帶，轉(zhuǎn)移至另一1×PBS培養(yǎng)皿中，重復(fù)3次。
(3)將臍帶剪成4 cm左右小段，再清洗3次。
(4)去臍帶血管、羊膜，取華通膠。
(5)華通膠轉(zhuǎn)移至1個(gè)50 ml離心管中，剪碎至糜狀。
(6)T175瓶中加入40 ml人臍帶干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。
(7)按每個(gè)T175瓶1 ml組織接種?；靹?，靜置培養(yǎng)。
(8)靜置培養(yǎng)5 d以上，觀察貼壁克隆少，繼續(xù)培養(yǎng)。
(9)培養(yǎng)7 d后，觀察貼壁克隆多，加培養(yǎng)基培養(yǎng)。
(10)培養(yǎng)9 d后，克隆已有較大規(guī)模增殖，繼續(xù)培養(yǎng)。
(11)培養(yǎng)第10天，按1:1傳代于新T175瓶。同時(shí)，組織轉(zhuǎn)移至新T175瓶進(jìn)行二次遷移。

四、細(xì)胞生長情況

培養(yǎng)9 d，細(xì)胞首次貼壁情況：

傳代3d后，細(xì)胞生長情況：

將P0中的組織取出進(jìn)行二次遷移，3d后貼壁狀況：

五、實(shí)驗(yàn)總結(jié)

本次實(shí)驗(yàn)歷時(shí)18天，成功分離培養(yǎng)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞。臍帶組織塊貼壁正常（通常臍帶組織貼壁形成克隆時(shí)間在5-10天）。觀察到貼壁細(xì)胞形態(tài)為長梭狀，邊緣明亮。在首次傳代中，P1代細(xì)胞形態(tài)正常，密度均勻。此后傳代3次，無老化現(xiàn)象。匯合度較高時(shí)，細(xì)胞呈明顯漩渦狀極性。本產(chǎn)品可正常提取、培養(yǎng)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)：
1.?Stefańska K, O?egowska K, Hutchings G, Popis M, Moncrieff L, Dompe C, Janowicz K, Pieńkowski W, Gutaj P, Shibli JA, et al. Human Wharton’s Jelly—Cellular Specificity, Stemness Potency, Animal Models, and Current Application in Human Clinical Trials. Journal of Clinical Medicine. 2020; 9(4):1102. https://doi.org/10.3390/jcm9041102

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