通過流式細胞術(shù)進行 PBMC（外周血單核細胞）?分析可廣泛應(yīng)用于研究和臨床研究，包括 HIV 研究、癌癥免疫治療和基于細胞因子的免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)研究。PBMCs通常通過密度梯度離心或磁珠分離從外周血、骨髓和臍帶中提取。這些方法旨在將白細胞與紅細胞 (RBC) 等其他細胞成分分離。 流式細胞術(shù)的一個常見應(yīng)用是 PBMC 免疫表型分析。該技術(shù)測量被稱為“分化簇”(CD) 標記的細胞表面分子的表達，以識別、區(qū)分和表征 PBMC 亞群。除了 CD 標記表達之外，計數(shù)和細胞大小的精確監(jiān)測對于該分析也至關(guān)重要。其中一個例子是嵌合抗原受體 T (CAR-T) 細胞癌癥免疫治療領(lǐng)域。 為了表征 PBMC 上的 CD 標記，將針對 CD 標記的抗體與藻紅蛋白 (PE) 等熒光團綴合。然后使用流式細胞儀測量熒光強度，以量化 CD 標記表達水平并區(qū)分 PBMC 亞群。本應(yīng)用說明演示了用于表征 PBMC 上 CD 標記的單熒光團和雙熒光團 PBMC 染色技術(shù)。

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CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的制備

材料：

·?1.Buccutite? 快速 PE 抗體標記試劑盒（貨號 1310）

注意

：試劑盒足以進行 2 次標記反應(yīng)，每個反應(yīng) 100 μg 抗體 ·?2.Buccutite? 快速 APC 抗體標記試劑盒（貨號 1311）

注意

：試劑盒足以進行 2 次標記反應(yīng)，每個反應(yīng) 100 μg 抗體 ·?3.1X PBS 緩沖液 (pH 7.2 – 7.4) ·?4.4 個 2 mL 洗滌管 ·?5.4 個 1.5 mL 收集管 ·?6.離心機 所有 CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物均使用以下應(yīng)用說明制備： ·?Buccutite? 快速藻膽蛋白抗體偶聯(lián)

PBMC的制備

冷凍保存的PBMC解凍并制備如下： 材料： 1.人類PBMC（冷凍保存，1000萬個細胞/瓶） 2.血細胞培養(yǎng)基 3.胎牛血清 4.15mL錐形管 5.?離心機 6.?吸管 ? 制備方法 1.?收到冷凍的 PBMC 后，立即解凍細胞并開始培養(yǎng)，以保持最高的細胞活力。 2.?要解凍細胞，請將小瓶放入 37°C 水中，輕輕攪拌約 1 分鐘。 a.?

注意：

將蓋子遠離水以盡量減少污染風險。 3.?將細胞移入含有 10% 胎牛血清的 10 mL 新鮮血細胞培養(yǎng)基的 15 mL 錐形管中。 a.?

注意

：總體積 = 10.1 mL（100 μL PBMC + 9 mL 新鮮血細胞培養(yǎng)基 + 1 mL 胎牛血清） 4.?在室溫下以 1,000 rpm (~220g) 離心 5 分鐘。 5.?取出上清液，細胞即可使用。

PBMC 的單熒光團和雙熒光團染色：

前兩節(jié)中制備的綴合物和 PBMC 用于以下細胞表面免疫標記方案。

材料：

·?1.PBMC ·?2.HHBS 緩沖液（ 貨號 20011） ·?3.測定緩沖液（含 1% BSA 的 HHBS 緩沖液） ·?4.臺盼藍鈉鹽*超純級*（ 貨號 2452） ·?5.TruStain FcX?CD45 – PE 結(jié)合物 ·?6.CD45 – APC 綴合物 ·?7.CD4 – FITC 綴合物 ·?8.CD3 – APC 綴合物 ·?9.小鼠 IgG – PE 綴合物 ·?10.小鼠 IgG – APC 綴合物 ·?11.NovoCyte 3000 流式細胞儀 ?

PBMC 染色：

1.?在免疫標記之前，使用臺盼藍染料排除測試（2452）確定 PBMC 活力，每個樣品使用 100 萬個細胞。 2.?用 HHBS 緩沖液（ 20011）通過離心機以 1000 RPM 洗滌 PBMC 2 次，每次洗滌 5 分鐘。 3.?為了阻斷非特異性 Fc 介導的相互作用，將 PBMC 重懸于含有 1% BSA 溶液的 HHBS 緩沖液和 Human TruStain FcX??5 μL/100 μL 檢測緩沖液中，并在室溫10分鐘。 4.?對于單熒光團 PBMC 染色，將 PBMC 與終濃度 0.1 μg 的 CD45-PE、CD45-APC、小鼠 IgG-PE 或小鼠 IgG-APC 在冰上避光孵育 20 分鐘。 5.?對于雙熒光團 PBMC 染色，將 PBMC 與 CD45-PE 和 CD4-FITC 以及 CD45-PE 和 CD3-APC 共孵育。所有四種染料的終濃度均為 0.5 μg，在冰上避光保存 20 分鐘。用 Assay Buffer 清洗 PBMC 兩次，然后將 PBMC 重懸于 Assay Buffer 中。 6.?在流式細胞儀上進行分析。 使用 Buccutite? 綴合技術(shù)生成的綴合物可提供高質(zhì)量的產(chǎn)量。這些綴合物在 PBMC 上進行了測試，并且可以靈活地與其他綴合物組合進行多色染色，以檢測 PBMC 中的 CD 標記。