如何制作穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系
如何制作穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系
轉(zhuǎn)染是一種基因轉(zhuǎn)移方法，其中遺傳物質(zhì)通過化學(xué)或非化學(xué)方法故意引入宿主細(xì)胞。有兩種類型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系：
穩(wěn)定細(xì)胞系的主要類型是通過將轉(zhuǎn)染的DNA直接整合到宿主生物體的基因組中而產(chǎn)生的。轉(zhuǎn)染的DNA通過同源重組整合到基因組中。
產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的另一種方法是轉(zhuǎn)染DNA的游離體維持。真核載體用于轉(zhuǎn)染未整合到基因組中的DNA。然而，游離體DNA的穩(wěn)定性很低。此外，附生體僅由某些類型的物種維持。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如圖1所示。
圖1：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系
步驟
生成穩(wěn)定細(xì)胞系所涉及的步驟如下所述。
生成確定最佳選擇抗生素濃度的殺傷曲線 – 細(xì)胞承受越來越多的抗生素濃度，以確定在一周內(nèi)殺死所有細(xì)胞所需的最低抗生素濃度。
轉(zhuǎn)染具有所需質(zhì)粒構(gòu)建體的細(xì)胞 – 轉(zhuǎn)染方法因宿主細(xì)胞類型而異。脂質(zhì)體試劑用于貼壁細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)染或病毒方法用于轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞系。
選擇和擴(kuò)增穩(wěn)定的多克隆菌落 – 在轉(zhuǎn)染 48-72 小時時，將高濃度、最佳濃度和低濃度的選擇性抗生素添加到培養(yǎng)物中，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
如何在細(xì)胞系中選擇轉(zhuǎn)染的DNA
選擇標(biāo)記與轉(zhuǎn)染的DNA共表達(dá)，用于選擇成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。標(biāo)記基因可能位于用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的同一載體（順式）中，也可能位于另一個載體（反式）中。對抗生素的耐藥性，如新霉素，沸蛋白，潮霉素，嘌呤霉素，DHFR等可用于選擇。此外，轉(zhuǎn)染的基因可以用GFP標(biāo)記。
結(jié)論
穩(wěn)定的細(xì)胞系主要可以通過將轉(zhuǎn)染的DNA整合到基因組中來制造。此外，轉(zhuǎn)染DNA的游離體維持也可用于在某些宿主生物中長時間制造穩(wěn)定的細(xì)胞系。應(yīng)該有一種選擇方法用于鑒定細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染的DNA。
