關(guān)于一節(jié)關(guān)于CRISPR Cas9系統(tǒng)的課程內(nèi)容，老師介紹了一些基本概念和技術(shù)。首先，老師回顧了上次課講的同源重組和它的優(yōu)點(diǎn)，例如它是位點(diǎn)特異性的，并且可以在沒有限制性酶的情況下構(gòu)建大型插入物。但是，同源重組在某些生物中效率較低，如哺乳動物和高等真核生物。然后老師介紹了CRISPR Cas9系統(tǒng)，這是一種高效的位點(diǎn)特異性修飾技術(shù)，它可以用于幾乎所有生物。CRISPR Cas9系統(tǒng)中的CRISPR是“clustered regularly interspaced palindromic repeats”的縮寫，它是一種在原核生物和真核生物中都存在的保守機(jī)制。老師還解釋了如何通過測序和BLAST尋找重復(fù)序列，以及如何識別回文序列。

介紹了CRISPR基因編輯技術(shù)的起源和原理。CRISPR是一種免疫途徑，最初是為了幫助原核生物抵御病毒而發(fā)現(xiàn)的。CRISPR是由三個(gè)主要組成部分組成的：CRISPR RNA，tracer RNA和Cas9蛋白。CRISPR RNA是一種與病毒匹配的RNA序列，tracer RNA是一個(gè)不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA序列，但它能夠與Cas9蛋白結(jié)合，并將其與CRISPR RNA粘合在一起。Cas9蛋白是一種內(nèi)切酶，可以切割DNA，用于編輯基因。通過這種方式，CRISPR技術(shù)能夠使科學(xué)家精確地編輯DNA序列，以治療疾病、改善農(nóng)業(yè)等方面發(fā)揮重大作用。

講述了CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）系統(tǒng)的功能和應(yīng)用。CRISPR是一種天然的細(xì)菌免疫系統(tǒng)，可以保護(hù)細(xì)菌免受病毒感染。它由蛋白質(zhì)和RNA組成的復(fù)合物（RNP）組成。RNP通過匹配病毒基因組的序列來切割病毒基因組，以保護(hù)細(xì)菌免受病毒感染。在自然環(huán)境中，細(xì)菌會將病毒基因組的一小段整合到它們自己的基因組中，以便在將來遇到同樣的病毒時(shí)更好地保護(hù)自己。

在生物技術(shù)中，CRISPR系統(tǒng)被改造用于基因編輯和基因治療。科學(xué)家Jennifer Doudna領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)發(fā)明了一種名為“guide RNA”的新型RNA，可以指導(dǎo)Cas9蛋白質(zhì)切割指定的DNA序列。通過改變guide RNA的序列，人們可以選擇性地切割和編輯基因。這種技術(shù)有望在基因治療和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

講述了CRISPR系統(tǒng)的生物技術(shù)進(jìn)展。首先介紹了CRISPR Cas9系統(tǒng)可以通過修改guide RNA來實(shí)現(xiàn)在DNA中精準(zhǔn)切割任何需要切割的基因。同時(shí)，科學(xué)家們還通過將核定位信號添加到CRISPR Cas9中，使其能夠進(jìn)入真核細(xì)胞核內(nèi)切割DNA，這是第一次成功修改真核細(xì)胞的嘗試。其次，文本介紹了CRISPR在基因組編輯中的應(yīng)用，包括如何通過兩種方式——非同源端連接和同源重組——修復(fù)切割的DNA。此外，文本還強(qiáng)調(diào)了CRISPR系統(tǒng)的編輯過程比人們想象的要復(fù)雜得多。

講述了利用CRISPR Cas9技術(shù)進(jìn)行基因編輯的過程以及兩種不同的基因敲除方式。在進(jìn)行基因編輯時(shí)，需要進(jìn)行同源重組來修復(fù)基因，因此需要兩個(gè)同源序列。而進(jìn)行基因敲除時(shí)，可以使用兩種方式，一種是直接切斷基因，另一種是在多個(gè)位置切割基因，以達(dá)到完全刪除的目的。在進(jìn)行基因編輯時(shí)，需要使用Cass 9和一個(gè)匹配Gnax的引導(dǎo)RNA，以及一個(gè)含有Gnax和His tag的質(zhì)粒。同時(shí)，文章還介紹了CRISPR Cas9技術(shù)中的multiplexing的概念，即在多個(gè)位置同時(shí)切割基因，以提高效率。

講述了CRISPR技術(shù)如何通過homologous recombination實(shí)現(xiàn)基因編輯，以及如何在人類細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯。使用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯時(shí)，需要提供一個(gè)template來實(shí)現(xiàn)homologous recombination，CRISPR只是負(fù)責(zé)切斷基因，并需要提供一個(gè)template來進(jìn)行編輯。在進(jìn)行CRISPR基因編輯時(shí)，需要將RNP（包括CAST9和guide RNA）送入細(xì)胞中，可以通過轉(zhuǎn)染或微注射等方式實(shí)現(xiàn)。在這個(gè)過程中，通常會使用兩種質(zhì)粒，第一個(gè)質(zhì)粒含有CAST9基因，第二個(gè)質(zhì)粒含有g(shù)uide RNA基因，以及一些啟動子和誘導(dǎo)子等輔助元素。此外，還可以通過制備RNP的方法將CAST9和guide RNA從細(xì)胞中提取出來，然后混合在一起進(jìn)行編輯。最后，在進(jìn)行CRISPR基因編輯時(shí)，需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，通常使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基來進(jìn)行。

講述了基因編輯的多種方法和如何驗(yàn)證編輯是否成功的過程。其中，可以通過 RNP、轉(zhuǎn)基因插入等方式將 Cas9 遞送到細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯，然后通過 PCR 和電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否成功。如果是插入，需要設(shè)計(jì)合適的引物。整個(gè)過程中，基因編輯只是第一步，驗(yàn)證編輯是否成功同樣重要。

CRISPR和agrobacterium在生物技術(shù)中的應(yīng)用。在討論CRISPR時(shí)，重點(diǎn)討論了如何驗(yàn)證和解決CRISPR在基因編輯中的問題，包括驗(yàn)證基因編輯是否成功、CRISPR的局限性和潛在的off-target效應(yīng)。在討論agrobacterium時(shí)，重點(diǎn)討論了為什么需要制造轉(zhuǎn)基因植物以及agrobacterium在制造轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。其中，制造殺蟲植物和黃金大米是轉(zhuǎn)基因植物的兩個(gè)主要應(yīng)用場景。

利用農(nóng)桿菌是插入轉(zhuǎn)基因的最常見方法之一，因?yàn)檗r(nóng)桿菌可以將DNA插入植物細(xì)胞中。農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性菌，具有兩個(gè)薄的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。農(nóng)桿菌是一種植物病原菌，可以導(dǎo)致植物形成腫瘤（也稱為galls）。農(nóng)桿菌有一個(gè)特殊的質(zhì)粒，稱為ti質(zhì)粒，其中包含了一些vera基因，這些基因編碼了一個(gè)分泌系統(tǒng)，可以將細(xì)胞內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，導(dǎo)致植物感染。Vera基因之所以被稱為vera基因，是因?yàn)樗鼈兙幋a的蛋白質(zhì)可以使植物發(fā)生變異，即產(chǎn)生病變的現(xiàn)象。ti質(zhì)粒還有其他一些基因，包括Aux/IAA和ARF基因，這些基因可以調(diào)節(jié)植物激素的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響植物的生長和發(fā)育。講述了植物農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的T-DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，這是一種用于生物技術(shù)的重要工具。農(nóng)桿菌帶有一種稱為Ti質(zhì)粒的DNA分子，其中包含一個(gè)T-DNA區(qū)域，它可以被細(xì)菌轉(zhuǎn)移至寄主植物細(xì)胞，并插入到植物染色體中，導(dǎo)致發(fā)生瘤形成。在農(nóng)桿菌中，VIR蛋白質(zhì)可以幫助T-DNA轉(zhuǎn)移。為了將目標(biāo)基因X導(dǎo)入植物，可以將基因X插入到T-DNA區(qū)域中，并使用農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)將其傳遞到植物細(xì)胞中。這個(gè)過程需要使用兩個(gè)質(zhì)粒：一個(gè)是帶有T-DNA區(qū)域的質(zhì)粒，另一個(gè)是帶有VIR基因的助質(zhì)粒。將這兩個(gè)質(zhì)粒共同投入到農(nóng)桿菌中，再將其接種到植物上，就可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移。從植物細(xì)胞的再生到如何選擇轉(zhuǎn)基因植物，再到介紹農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因的優(yōu)缺點(diǎn)，以及Bt細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)和生命周期。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的過程利用了其自身的T-DNA片段，通過插入選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。Bt細(xì)菌最初是由一位德國谷物學(xué)家發(fā)現(xiàn)的，他發(fā)現(xiàn)某些谷物中有害蟲并研究了這些有害蟲的生命周期，最終發(fā)現(xiàn)了Bt細(xì)菌并將其用于殺蟲。

生命周期：介紹了一種名為BT（巴基桿菌）的細(xì)菌，它可以通過在幼蟲的腸道內(nèi)形成蛋白晶體來殺死昆蟲，從而保護(hù)植物免受昆蟲侵害。BT的晶體在昆蟲腸道中溶解，然后通過破壞腸道細(xì)胞膜進(jìn)入昆蟲體內(nèi)殺死昆蟲。細(xì)菌形成孢子，這些孢子中包含有晶體，使其可以在昆蟲出現(xiàn)之前長期存活。BT與植物之間可能存在共生關(guān)系，從而保護(hù)植物免受昆蟲侵害。

機(jī)制：BT的晶體形成在其cry基因的c末端，由該基因的n末端的受體結(jié)合域和c末端的cry結(jié)構(gòu)域組成。這些晶體在堿性的昆蟲腸道中被溶解，cry受體結(jié)合域與細(xì)胞蛋白cadherin結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞膜并打開孔隙，細(xì)胞死亡，BT進(jìn)入昆蟲體內(nèi)殺死昆蟲。

特點(diǎn)：BT在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用廣泛，因?yàn)樗梢跃_殺死目標(biāo)昆蟲而不會損害植物或人類健康。

Bt殺蟲劑非常有效，能夠針對特定種類的昆蟲進(jìn)行殺滅。這是因?yàn)锽t殺蟲劑所含的cry蛋白是針對特定昆蟲的，因?yàn)椴煌ハx的Cadherin蛋白序列不同，cry蛋白只能與特定種類的Cadherin蛋白相互作用。這也是為什么Bt殺蟲劑很受歡迎的原因之一。此外，這些句子還討論了Bt殺蟲劑抗性的發(fā)展機(jī)制，最常見的機(jī)制包括靶標(biāo)位點(diǎn)抗性、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變和蛋白酶Tripsin的突變，這些突變都可能導(dǎo)致Bt殺蟲劑失去效果。

介紹了昆蟲如何通過突變或基因敲除來抵抗殺蟲劑。其中，靶標(biāo)位點(diǎn)抵抗是一種常見的抵抗機(jī)制，而行為抵抗則是另一種類型的抵抗。

接下來，介紹了使用Bt（Bacillus thuringiensis）基因的轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)的過程。這是生物技術(shù)領(lǐng)域中最著名的例子之一，通過將Bt基因插入玉米中，使得昆蟲食用后會死亡。

然而，昆蟲抵抗Bt玉米的情況也越來越普遍。為了減少抗性的發(fā)生，人們采用了一些策略，如金字塔策略和避難策略。金字塔策略是指將多個(gè)Bt基因插入轉(zhuǎn)基因植物中，以防止昆蟲演化出對其中一個(gè)基因的抵抗力。避難策略則是在轉(zhuǎn)基因玉米和野生玉米之間留出一定比例的野生玉米，以便使得沒有接觸到Bt基因的昆蟲能夠存活下來。在種植轉(zhuǎn)基因作物時(shí)，如果只種植一種抗蟲品種，會導(dǎo)致蟲害產(chǎn)生抗性，從而影響作物產(chǎn)量。因此，使用“庇護(hù)”策略，即在農(nóng)田中種植10%的野生型作物，使部分蟲害無法被抗蟲作物殺死，從而減緩蟲害產(chǎn)生抗性的速度。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種細(xì)胞膜蛋白，它能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)運(yùn)進(jìn)或運(yùn)出細(xì)胞。在轉(zhuǎn)基因作物中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與抗蟲蛋白Cry結(jié)合，將其帶入細(xì)胞膜并打開孔洞，使細(xì)胞破裂死亡。Cry蛋白有兩個(gè)部分，RBSD和Cry區(qū)域，其中RBSD結(jié)合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Cry區(qū)域則呈結(jié)晶態(tài)。此外，如果有問題可以向老師提問，老師會在測試中給予額外的分?jǐn)?shù)。