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融合基因(Fusion)主要檢測方法

2022-09-16 16:43 作者:Cas9X海星生物 0人讀過 | 我要投稿

一、融合基因定義

融合基因：是指兩個基因的全部或一部分的序列相互融合為一個新的基因的過程。其有可能是染色體易位、中間缺失或染色體倒置所致的結(jié)果。
基因融合是由原本兩個獨立的基因形成的雜合基因，一般發(fā)生在基因組層面，根據(jù)融合斷點位置的不同，有些基因融合會發(fā)生轉(zhuǎn)錄有些則不發(fā)生轉(zhuǎn)錄，除了基因組上會發(fā)生融合外，在轉(zhuǎn)錄本層面也會發(fā)生基因融合現(xiàn)象；當然需要補充的是有一些基因會和基因間區(qū)發(fā)生融合，理論上基因間區(qū)斷點融合不太可能起作用，但是已有研究發(fā)現(xiàn)基因間區(qū)斷點融合是可能被激活的。

二、基因融合檢測技術(shù)

目前常見的基因融合檢測分子病理檢測方法包括：熒光原位雜交（FISH）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、免疫組織化學（IHC）、二代測序技術(shù)（NGS）等。其他技術(shù)平臺，如數(shù)字PCR、Nanostring 等也逐漸成熟，有待進入臨床應用積累更多的臨床實踐經(jīng)驗。

2.1? FISH（熒光標記原位雜交）

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）：FISH檢測是利用熒光基團標記DNA探針，再將標記的DNA探針與樣本DNA進行原位雜交，最后在熒光顯微鏡下對熒光信號進行計數(shù)，以此作為診斷的依據(jù)。探針是FISH檢測靈敏度和準確性的關鍵。FISH檢測的準確性來源于探針的設計。FISH能否應用于某一領域也取決于是否具有相應的探針。用于FISH檢測的探針必須具備很高的特異性，能特異性地識別特定的基因或染色體上特定的片段。而且FISH的探針必須能經(jīng)受原位雜交的處理而不變性。熒光基團的標記也直接影響了檢測的靈敏度和原位雜交結(jié)果的檢測方式。目前使用最廣泛的是利用特殊熒光標記的堿基通過模板合成出特異性強的熒光標記的探針鏈。目前為止，F(xiàn)ISH技術(shù)已經(jīng)十分成熟，目前已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)全染色體，部分染色體的單標記，以及染色體的多重標記檢測。當前為了增加FISH的準確性，目前多采取多色標記。目前檢測基因融合的FISH探針長度一般在400 kb-5 Mb之間。

2.2? IHC（免疫組織化學）

IHC基于蛋白層面檢測基因融合，利用抗原‐抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及相對定量的檢測技術(shù)；IHC與目前的現(xiàn)有分子檢測方法相比更經(jīng)濟、更快速，但是結(jié)果判讀時存在一定的主觀性，對弱陽性結(jié)果的判斷需要進一步用FISH等技術(shù)來驗證。

2.3? RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應）

RT-PCR可以在RNA水平上高度敏感地檢測融合轉(zhuǎn)錄本，不過只能檢測一些已知的基因融合形式，無法檢測未知融合，這種方法受到 RNA 質(zhì)量的影響較大，所以有可能造成一些假陰性的結(jié)果。

2.4??DNA or RNA 測序

合基因作為結(jié)構(gòu)變異(SV)的一種類型，采用DNA測序分析融合基因的策略主要包括：雙端序列配對法(pair-end method)，該方法總體思路是首選將雙端序列比對到基因組上，然后評估雙端配對序列的距離和方向是否和建庫信息一致。

RNA測序檢測融合基因主要有兩種分析策略，(1) 基于序列比對的方法，尋找不一致序列(discordant pair reads)和覆蓋斷裂點的序列(junction/split reads)從而識別出融合事件。(2) 基于拼接比對的方法，首先組裝出新的轉(zhuǎn)錄本，然后比對到基因組，從而鑒定出與染色體重排一致的融合轉(zhuǎn)錄本。

2.5? Nanostring

Nanostring技術(shù)是數(shù)字化基因分析系統(tǒng)，是最新的多重基因定量檢測技術(shù)。該技術(shù)可直接檢測條形碼探針標記的單個mRNA轉(zhuǎn)錄子，并通過數(shù)字計數(shù)進行定量。它僅需100 ng的RNA即可對逾800個特異的mRNA轉(zhuǎn)錄子進行準確的定量。該方法除了檢測已知融合方式，還能發(fā)現(xiàn)未知融合方式。有文章報道NanoString和FISH檢測在檢測肺癌ALK、ROS、RET 基因融合方面一致性可高達100%。技術(shù)準確性層面NanoString應用于臨床檢測具有可行性。NanoString技術(shù)平臺自動化程度非常高，通過機器就可以直接讀數(shù)，并且單次反應能夠同時檢測800多條序列，高通量檢測可以大大節(jié)約臨床標本，針對單個基因的檢測成本也大大降低。但是目前國內(nèi)由于設備未能普及，另外還有融合探針的合成、試劑性能驗證、NMPA 批準等因素，短期內(nèi)應用于臨床尚不現(xiàn)實。