寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由武漢大學(xué)中南醫(yī)院生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)系在2020年1月13日發(fā)表于Journal of Experimental Medicine（2020IF：14.307，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Bo Zhong教授，研究表明USP22通過(guò)去泛素化輸入蛋白KPNA2來(lái)促進(jìn)IRF3核易位和抗病毒反應(yīng)。

研究背景

????????去泛素化酶 (DUB) 從靶蛋白中去除多聚或單泛素綴合物，從而調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性或活性。泛素特異性蛋白酶 (USP) 22屬于DUB的USP亞家族，與小鼠胎盤(pán)發(fā)育和人類(lèi)癌癥有關(guān)。

摘要部分

????????在這里，作者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)USP22通過(guò)在病毒感染后去泛素化和穩(wěn)定KPNA2來(lái)促進(jìn)IRF3的核易位。病毒感染以依賴(lài)KPNA2的方式誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中的USP22-IRF3結(jié)合，并且敲低或敲除USP22或KPNA2會(huì)損害病毒感染后IRF3核易位和下游基因的表達(dá)。一致地，與相應(yīng)的對(duì)照同窩仔鼠相比，Cre-ER Usp22fl/fl或Lyz2-Cre Usp22fl/fl小鼠在病毒感染后產(chǎn)生的I型干擾素水平降低，并且對(duì)致命病毒感染的易感性增加。從機(jī)制上講，USP22在病毒感染后使KPNA2去泛素化并穩(wěn)定化，以促進(jìn)IRF3的有效核易位。將KPNA2重組為USP22敲除細(xì)胞，恢復(fù)了病毒引發(fā)的IRF3核易位和細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)定義了細(xì)胞質(zhì)USP22以前未知的功能，并在USP22和IRF3核易位之間建立了聯(lián)系，從而擴(kuò)展了傳染病的潛在治療策略。

研究?jī)?nèi)容

1.USP22與病毒感染后的IRF3相關(guān)

????????IRF3是一種轉(zhuǎn)錄因子，可在病毒感染后介導(dǎo)大量基因的表達(dá)。作者通過(guò)免疫共沉淀和免疫印跡分析來(lái)篩選與IRF3相互作用的DUB。最終將USP22鑒定為IRF3相互作用的DUB。在平行的報(bào)告基因篩選試驗(yàn)中，USP22激活仙臺(tái)病毒（SeV）誘導(dǎo)的干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）啟動(dòng)子的激活。USP22位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，并且USP22的敲低會(huì)損害病毒觸發(fā)的下游基因表達(dá)。USP22在IRF3的調(diào)控方面比其他DUB有更高的可能性。因此作者選擇了USP22進(jìn)行進(jìn)一步研究。作者接下來(lái)檢查了IRF3和USP22之間的內(nèi)源性關(guān)聯(lián)，免疫印跡分析顯示，在SeV或HSV-1感染后，USP22與小鼠BMDC和MEF中的IRF3相互作用。據(jù)報(bào)道，USP22位于細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)中。作者觀察到，在BMDC中水泡性口炎病毒（VSV）或HSV-1感染后，USP22與細(xì)胞質(zhì)中的IRF3和磷酸化IRF3（pIRF3）相互作用，但不在細(xì)胞核中相互作用。N端的四個(gè)堿性氨基酸殘基(163-KRRK-166)是USP22核定位所必需的NLS。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)USP22 (RR164/165AA)仍然與IRF3相關(guān)。域映射分析的結(jié)果表明USP22的C端泛素肽酶域(aa169-525)負(fù)責(zé)它們的關(guān)聯(lián)。

研究結(jié)論：病毒感染后USP22與細(xì)胞質(zhì)中的IRF3相互作用。

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2.USP22的敲低抑制人細(xì)胞系中的RF3核聚集

????????為了確定USP22是否是IRF3的生理調(diào)節(jié)劑，作者設(shè)計(jì)了靶向USP22的siRNA。定量逆轉(zhuǎn)錄qRT-PCR分析的結(jié)果表明，USP22的敲低抑制了SeV或HSV-1誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中IFNB、ISG56和CCL5的表達(dá)以及SeV誘導(dǎo)的IFNB、ISG56和HeLa細(xì)胞中的CCL5。先前的研究表明，USP22 與 ENY2 和 ATXN7L3 相互作用并形成轉(zhuǎn)錄共激活因子 SAGA 復(fù)合物，以調(diào)節(jié) H2B 單泛素化水平。然而，敲除ENY2或ATXN7L3對(duì)SeV誘導(dǎo)的IFNB、ISG56和CXCL10在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，表明USP22以獨(dú)立于SAGA復(fù)合物形成的方式調(diào)節(jié)人類(lèi)細(xì)胞系中病毒觸發(fā)的下游基因表達(dá)。IRF3的磷酸化和二聚化是病毒感染后IRF3激活的兩個(gè)標(biāo)志。然而，SeV或HSV-1誘導(dǎo)的IRF3磷酸化并未因THP-1細(xì)胞中USP22的敲低而受損。此外，USP22的過(guò)表達(dá)和敲低均不影響病毒誘導(dǎo)的IRF3在THP-1或HeLa細(xì)胞中的二聚化。另一方面，作者發(fā)現(xiàn)在SeV或HSV-1感染后，USP22的敲低顯著削弱了IRF3在THP-1細(xì)胞中的核積累。這些數(shù)據(jù)共同表明USP22參與病毒感染后IRF3的核積累。

研究結(jié)論：USP22參與病毒感染后IRF3的核積累。

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3.敲除小鼠原代細(xì)胞中的USP22會(huì)削弱病毒觸發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)

????????USP22與小鼠的早期胚胎發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，人類(lèi)癌癥和小鼠USP22的胚系缺失會(huì)導(dǎo)致早期胚胎缺陷。為了進(jìn)一步研究USP22在體內(nèi)抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，作者成功構(gòu)建USP22敲除小鼠（Cre-ER Usp22fl/fl），該小鼠具有正常的免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

????????作者接下來(lái)檢查了各種4-羥基三苯氧胺(4-OHT)處理的Cre-ER Usp22fl/+和Cre-ER Usp22fl/fl細(xì)胞中病毒觸發(fā)的下游基因誘導(dǎo)。正如預(yù)期的那樣，與Cre-ER Usp22fl/+對(duì)應(yīng)物相比，4-OHT處理的Cre-ER Usp22fl/flBMDC和骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM）中Usp22的表達(dá)減少。qRT-PCR分析的結(jié)果表明，敲除USP22會(huì)顯著削弱SeV-、VSV-、HSV-1-或轉(zhuǎn)染的poly(I:C)-、細(xì)胞質(zhì)DNA-和LPS誘導(dǎo)的Ifnb、Isg15和Ccl5在BMDC和BMDM中的表達(dá)。此外，BMDC中USP22的敲除顯著削弱了細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中VSV-、HSV-1-或配體誘導(dǎo)的IFN-β和CCL5的產(chǎn)生。與在人類(lèi)細(xì)胞系中觀察到的結(jié)果一致，SeV或HSV-1誘導(dǎo)的IRF3磷酸化或二聚化不受BMDC或MEF中USP22敲除的影響。相反，敲除BMDC或MEF中的USP22顯著抑制了IRF3在細(xì)胞核中的積累，表明USP22促進(jìn)病毒觸發(fā)的IRF3核易位。與這一觀點(diǎn)一致，BMDC或MEF中USP22的敲除顯著促進(jìn)了野生型或GFP標(biāo)記的VSV或HSV-1復(fù)制，如噬菌斑測(cè)定和流式細(xì)胞術(shù)分析所示。

????????作者還通過(guò)雜交Usp22fl/+小鼠和Lyz2-Cremice獲得了Lyz2-Cre Usp22fl/+和Lyz2-Cre Usp22fl/fl小鼠。與Cre-ER Usp22fl/fl細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)相似，Lyz2-Cre介導(dǎo)的USP22缺失顯著削弱了SeV或HSV-1誘導(dǎo)的Ifnb和Isg15在BMDC中的表達(dá)。此外，與Lyz2-Cre Usp22fl/+對(duì)應(yīng)物相比，SeV-或HSV-1誘導(dǎo)的IRF3核易位在Lyz2-Cre Usp22fl/fl?BMDCs或BMDMs中受到抑制。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡成像，與Lyz2-Cre Usp22fl/+BMDCs相比， VSV-GFP或H129-G4的復(fù)制在Lyz2-Cre Usp22fl/fl?BMDCs中顯著增強(qiáng)。

研究結(jié)論：USP22對(duì)于病毒觸發(fā)的IRF3核易位和隨后的細(xì)胞抗病毒反應(yīng)至關(guān)重要。

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4.USP22缺陷小鼠對(duì)病毒感染的易感性增加

????????為了表征USP22在體內(nèi)RNA病毒感染中的作用，作者連續(xù)5天將他莫昔芬(80mg/kg)腹腔注射到Cre-ER Usp22fl/+和Cre-ER Usp22fl/fl小鼠中，7天后，小鼠通過(guò)尾靜脈或腹腔注射感染VSV或HSV-1。Cre-ER Usp22fl/fl小鼠比對(duì)照同窩仔鼠更容易受到致死性VSV感染。此外，在VSV感染后12小時(shí)，對(duì)照小鼠相比，Cre-ER Usp22fl/fl小鼠血清中IFN-β和CCL5的濃度顯著降低。在VSV感染后24小時(shí)或4天，與Cre-ER Usp22fl/+小鼠相比，來(lái)自Cre-ER Usp22fl/fl小鼠的肺或腦中Ifnb、Isg15和Ccl5的表達(dá)嚴(yán)重受損。一致地，在腹腔注射VSV后4天，Cre-ER Usp22fl/fl小鼠的腦或腎臟中的VSV滴度顯著高于Cre-ER Usp22fl/+小鼠。同樣，作者觀察到敲除USP22導(dǎo)致對(duì)致死性HSV-1感染的易感性增加，并降低HSV-1感染后血清中IFN-β和CCL5的產(chǎn)生。此外，與Cre-ER Usp22fl/+小鼠相比，在HSV-1感染后24小時(shí)或4天，來(lái)自Cre-ER Usp22fl/fl小鼠的肺或腦中Ifnb、Isg15和Ccl5的表達(dá)分別嚴(yán)重受損。通過(guò)敲除USP22，大腦或脾臟中的HSV-1滴度顯著增加。類(lèi)似地，Lyz2-Cre對(duì)USP22的缺失導(dǎo)致對(duì)致死性VSV或HSV-1感染的易感性增加并減少VSV或HSV-1感染后血清中IFN-β和CCL5的產(chǎn)生。

研究結(jié)論：USP22正調(diào)節(jié)病毒誘導(dǎo)的下游基因表達(dá)，并且對(duì)于宿主體內(nèi)針對(duì)病毒的防御至關(guān)重要。

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5.USP22的酶活性是抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)所必需的

????????作者接下來(lái)檢查了USP22介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)激活是否需要核定位或去泛素化活性。將空載體、USP22、NLS突變體USP22 (RR164/165AA)或酶失活突變體USP22 (C185S)重組到Cre-ER Usp22fl/fl細(xì)胞中，然后進(jìn)行4-OHT處理和SeV、VSV或HSV-1感染。qRT-PCR和ELISA分析的結(jié)果表明，病毒誘導(dǎo)的Ifnb、Isg15、Ccl5或Isg56表達(dá)以及IFN-β和CCL5的產(chǎn)生在用USP22或USP22（RR/AA）重組的Cre-ER Usp22fl/flMEF中得到顯著恢復(fù)但在用USP22(C185S)重組時(shí)則沒(méi)有這種效果，表明酶活性而非USP22的核定位是病毒觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)所必需的。此外，通過(guò)將USP22或USP22（RR/AA）而非USP22（C185S）重組為Cre-ER Usp22fl/flMEF，SeV或HSV-1誘導(dǎo)的IRF3核易位增加。一致地，在用USP22重建的Cre-ER Usp22fl/flMEF中，VSV和HSV-1的復(fù)制也顯著減少。

研究結(jié)論：USP22介導(dǎo)的病毒觸發(fā)信號(hào)需要其去泛素化酶活性。

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6.USP22在IRF3水平起作用，但不針對(duì)IRF3進(jìn)行去泛素化

????????因?yàn)閁SP22介導(dǎo)的病毒觸發(fā)信號(hào)需要其酶活性并且USP22與IRF3相互作用，作者認(rèn)為USP22可能催化IRF3的去泛素化并調(diào)節(jié)IRF3的核易位。然而，作者發(fā)現(xiàn)SeV或HSV-1誘導(dǎo)的IRF3泛素化在4-OHT處理的Cre-ER Usp22fl/+和Cre-ER Usp22fl/flMEF之間具有明顯差異。此外，在VSV感染后，敲除USP22對(duì)IRF3的穩(wěn)定性影響很小。USP22的過(guò)表達(dá)或敲低分別增強(qiáng)或抑制了IRF3(5D)介導(dǎo)的ISRE報(bào)告基因的激活，而USP22(RR/AA)而不是USP22(C185S)的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了IRF3或IRF3(5D)介導(dǎo)的ISRE激活，表明細(xì)胞質(zhì)中USP22酶活性在促進(jìn)病毒觸發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)方面起主要作用。先前的研究表明，磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)介導(dǎo)的IRF3在Ser97處的去磷酸化促進(jìn)了其核易位。作者發(fā)現(xiàn)USP22的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了IRF3(S97A)介導(dǎo)的ISRE激活。

研究結(jié)論：USP22以依賴(lài)于其酶活性的方式促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IRF3在細(xì)胞質(zhì)中的核易位。

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7.USP22去泛素化并穩(wěn)定KPNA2

????????內(nèi)源性免疫沉淀試驗(yàn)的結(jié)果表明KPNA2與USP22組成型相互作用，但與THP-1細(xì)胞中的IRF3或pIRF3相互作用，其方式取決于病毒感染。KPNA2的敲低削弱了MEF中病毒誘導(dǎo)的USP22-IRF3關(guān)聯(lián)，表明USP22在病毒感染后通過(guò)KPNA2與IRF3相互作用。作者接下來(lái)檢查了在有無(wú)病毒感染的情況下，USP22充足或缺乏的MEF中KPNA2的泛素化。結(jié)果表明，病毒誘導(dǎo)的KPNA2泛素化通過(guò)敲除USP22得到顯著增強(qiáng)，并且將USP22而非USP22（C185S）重構(gòu)到USP22缺陷型MEF時(shí)，減少了KPNA2的泛素化。此外，USP22 或 ?????????????????????????????????????????USP22(RR164/165AA) 而不是 USP22(C185S) 在體外使 KPNA2 去泛素化，表明USP22直接催化KPNA2的去泛素化。正如預(yù)期的那樣，在VSV感染后，USP22缺陷的MEF中KPNA2的半衰期比USP22充足 的MEF短，這可以通過(guò)重構(gòu)USP22而不是USP22(C185S) 逆轉(zhuǎn)。在USP22敲除的MEFs中，KPNA2的加速降解被Bafilomycin A1或敲除ATG7完全挽救，但不被MG132挽救，表明USP22在病毒感染后去泛素化并保護(hù)KPNA2免受自噬依賴(lài)性降解。NDP52和p62是重要的選擇性自噬受體，能識(shí)別并將多聚物修飾的目標(biāo)運(yùn)送到自噬體。有趣的是，敲除NDP52而不是p62完全抑制了USP22缺陷的MEFs中病毒引發(fā)的KPNA2的降解。

研究結(jié)論：USP22介導(dǎo)的KPNA2的去泛素化通過(guò)NDP52介導(dǎo)的選擇性自噬途徑抑制KPNA2的降解。

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8.KPNA2介導(dǎo)病毒觸發(fā)的IRF3核易位? ? ?

????????作者接下來(lái)檢查了KPNA2對(duì)病毒觸發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)和IRF3核易位的影響，發(fā)現(xiàn)KPNA2的敲低顯著抑制了VSV或HSV-1誘導(dǎo)的Ifnb和Isg15在初級(jí)MEF或THP-1細(xì)胞中的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，KPNA2的敲低大大削弱了SeV或HSV-1感染后MEF中IRF3的核轉(zhuǎn)位，并促進(jìn)了THP-1細(xì)胞中VSV或HSV-1的復(fù)制。這些數(shù)據(jù)表明KPNA2對(duì)于病毒誘導(dǎo)的IRF3核易位和細(xì)胞抗病毒反應(yīng)至關(guān)重要。

????????正如預(yù)期的那樣，在SeV或HSV-1感染后，將KPNA2重組到USP22敲除的MEFs中可恢復(fù)Ifnb和Ccl5的表達(dá)以及IRF3的核易位。一致的是，在用KPNA2重構(gòu)的USP22敲除細(xì)胞中，VSV和HSV-1的復(fù)制被明顯抑制，而在用空載體重組的細(xì)胞中則沒(méi)有。

研究結(jié)論：USP22通過(guò)去泛素化和穩(wěn)定KPNA2來(lái)促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IRF3的核易位。

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結(jié)論與討論

????????在這項(xiàng)研究中,作者發(fā)現(xiàn)USP22在病毒觸發(fā)的IRF3核易位和細(xì)胞抗病毒反應(yīng)中的重要作用。USP22在病毒感染后以KPNA2依賴(lài)性方式與IRF3相互作用。USP22去泛素化并穩(wěn)定KPNA2，從而促進(jìn)病毒觸發(fā)的IRF3核易位和下游基因的后續(xù)表達(dá)。病毒感染后，敲除USP22會(huì)損害lRF3的核積累，并增強(qiáng)病毒在體外和體內(nèi)的復(fù)制，這可以通過(guò)KPNA2的重構(gòu)來(lái)恢復(fù)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)定義了細(xì)胞質(zhì)USP22以前未知的功能，并在USP22和IRF3核易位之間建立了機(jī)制聯(lián)系，從而擴(kuò)展了傳染病的潛在治療策略。

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原文鏈接：https://doi.org/10.1084/jem.20191174