不管你是每天被組會(huì)和數(shù)據(jù)逼得無(wú)線自我懷疑的研究僧,還是剛剛要進(jìn)入科研實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)小白,還是已經(jīng)是實(shí)驗(yàn)室扛把子的資深科研工作者,甚至你只是例行體檢,看過(guò)醫(yī)生給自己的體檢報(bào)告,你都會(huì)聽(tīng)到看過(guò)這樣的字眼,病理,染色。染色的方法千千萬(wàn),今天,小編就幫大家復(fù)習(xí)一下,最最常規(guī)的HE染色方法。

HE染色

蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色方法,簡(jiǎn)稱(chēng)HE染色方法,是常規(guī)病理制片最基本的染色,能夠?qū)φ＝M織和病理組織進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。

一、實(shí)驗(yàn)原理

1、細(xì)胞核染色的原理:蘇木精為堿性天然染料,可使細(xì)胞核著色。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA,在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中,兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外,使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負(fù)電荷,呈酸性,很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色,所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。

2、細(xì)胞漿染色的原理:伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料,在一定條件下可使細(xì)胞漿著色。細(xì)胞漿的主要成分是蛋白質(zhì),為兩性化合物,細(xì)胞漿的染色與染液的pH在胞漿蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(4.7—5.0)以下時(shí),胞漿蛋白質(zhì)以堿式電離,則細(xì)胞漿帶正電荷,就可被帶負(fù)電荷的酸性染料染色。伊紅在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子,與胞漿蛋白質(zhì)帶正電荷的陽(yáng)離子結(jié)合,使細(xì)胞漿著色,呈現(xiàn)紅色。

3、分化作用:染色后,用某些特定的溶液將組織過(guò)多結(jié)合的染色劑脫去,這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為分化作用,所用的溶液稱(chēng)為分化液。在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液,因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu),使組織與色素分離而褪色。經(jīng)蘇木精染色后,必須用0.5%鹽酸乙醇分化,使細(xì)胞核過(guò)多結(jié)合的蘇木精染料和細(xì)胞漿吸附的蘇木精染料脫去,在進(jìn)行伊紅染色,才能保證細(xì)胞核與細(xì)胞漿染色的分明。因此,在HE染色中分化是極為關(guān)鍵的一步。

4、返藍(lán)作用:分化之后,蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài),呈紅色,在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài),呈藍(lán)色。組織切片經(jīng)0.5%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色,故分化之后,立即用水出去組織切片上的酸而終止分化,再用弱堿性水(0.2%氨水)使蘇木精染上的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色,這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為返藍(lán)作用或藍(lán)化作用。另外用自來(lái)水浸洗也可使細(xì)胞核返藍(lán),但所需時(shí)間較長(zhǎng)。

二、實(shí)驗(yàn)材料和試劑:

1、蘇木精染液:

蘇木精染液配制方法有多種,Harris蘇木精染液是最常用的一種,其配方如下:

蘇木精:2g

無(wú)水乙醇:20ml

硫酸鋁鉀:20g

蒸餾水:200ml

氧化汞:0.5g

冰醋酸:8ml

配制步驟:先用無(wú)水乙醇溶解蘇木精,用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀,再將這兩種液體混合后煮沸(約1min),離火后向該混合液中迅速加入氧化汞,并用玻璃棒攪拌至染液變?yōu)樽霞t色(此時(shí)有大量氣泡產(chǎn)生,故容器宜大,以防液體溢出),隨即用冷水冷卻至室溫,然后加入冰醋酸并混勻,過(guò)濾后使用。

2、伊紅染液

伊紅染液有是水溶性和醇溶性?xún)煞N,常用的為0.5%水溶性伊紅染液,其配方如下:

伊紅Y:0.5g

95%乙醇:100ml

3、0.5%鹽酸乙醇分化液

36%—38%鹽酸:0.5ml

75%乙醇:99.5ml

4、0.2%氨水(pH在7.5—8之間)

25%—28%氨水:0.2ml

蒸餾水:100ml

三、染色步驟與方法:

1、烤片:60分鐘,溫度60℃(目的:使組織切片與載玻片貼合的更加緊密)

2、切片脫蠟至水:

? ? ?(1)二甲苯Ⅰ:10min

? ? (2)二甲苯Ⅱ:10min

? ? (3)二甲苯Ⅲ:10min

(4)無(wú)水乙醇Ⅰ:3-5min

? ? ?(5)無(wú)水乙醇Ⅱ:3-5min

? ? (6)95%乙醇Ⅰ:3-5min

?(7)90%乙醇:3-5min

? ? ?(8)80%乙醇:3-5min

? ? (9)75%乙醇:3-5min

(10)蒸餾水洗:5min

3、染色:

(1)木精染色:5-10min

? ? (2)蒸餾水洗:1min

(3)0.5%鹽酸乙醇分化:10s/10 to 20 quick dips

(4)蒸餾水洗:2min

(5)0.2%氨水返藍(lán):約40s

(6)蒸餾水洗:2×1min

(7)0.5%伊紅染色:5min

(8)蒸餾水速洗

4、脫水、透明、封固

? ? (1)80%乙醇:3min

? ? (2)90%乙醇:3min

? ? ?(3) 95%乙醇:3min

? ? ?(4)?無(wú)水乙醇Ⅰ:5min

? ? (5)?無(wú)水乙醇Ⅱ:5min

? ? (6)?二甲苯Ⅰ:5min

? ? (7)?二甲苯Ⅱ:5min

? ? ?(8)?二甲苯Ⅲ:5min

? ? (9)?中性樹(shù)膠封固

四、染色結(jié)果

細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞漿呈粉紅色至桃紅色,膠原纖維呈淡粉紅色,紅細(xì)胞呈較鮮艷的橘紅色。鈣鹽、細(xì)菌菌落呈藍(lán)色或紫藍(lán)色。

五、注意事項(xiàng)

1、染色前,切片脫蠟應(yīng)徹底。若脫蠟不徹底,則影響著色。

2、染色時(shí)間與染液的新舊程度有關(guān),不能一成不變。新配制的染液著色力較強(qiáng),染色時(shí)間可適當(dāng)縮短;反之,則適當(dāng)延長(zhǎng)。伊紅染色程度應(yīng)以蘇木精對(duì)核的著色程度為參照標(biāo)準(zhǔn),掌握其染色時(shí)間,以達(dá)到對(duì)比鮮明為宜。

3、伊紅染液的pH值不能低于細(xì)胞核染色體等電點(diǎn)(pI=3.3),否則染色體也可表現(xiàn)堿式電離帶正電荷,而被伊紅染液染色,使細(xì)胞漿與細(xì)胞核區(qū)分不開(kāi)。因此伊紅染液的pH值應(yīng)小于胞漿蛋白等電點(diǎn),而大于胞核染色體等電點(diǎn),在3.6-4.7之間。

4、掌握好分化程度,分化時(shí)要認(rèn)真觀察,精心操作,觀察切片由深藍(lán)色變成紅色或粉紅色時(shí),立即將切片置入自來(lái)水中終止分化。

5、封固用的中性樹(shù)膠的濃度要適宜,避免產(chǎn)生氣泡。如中性樹(shù)膠過(guò)稀,容易溢出蓋玻片的周?chē)?且樹(shù)膠內(nèi)的二甲苯易揮發(fā),樹(shù)膠干燥濃縮后可產(chǎn)生氣泡。如中性樹(shù)膠過(guò)濃稠,滴后不容易擴(kuò)散,有氣泡不易排出。若封固后氣泡存留,既影響切片觀察,又影響切片保存。因此有氣泡產(chǎn)生時(shí),應(yīng)輕輕按壓蓋玻片,將氣泡驅(qū)除。

6、脫蠟用二甲苯應(yīng)該經(jīng)常過(guò)濾,并定期更換新液,脫蠟時(shí)應(yīng)避免將二甲苯過(guò)多地帶入酒精中出現(xiàn)云霧現(xiàn)象。

7、為了加速脫蠟過(guò)程,可將切片預(yù)先進(jìn)行加溫,再行脫蠟。

8、蘇木素染色時(shí)間的長(zhǎng)短,主要依據(jù)氣溫的高低,染液的新舊,組織的差別以及組織所使用固定液不同而有所區(qū)別,很難提出一個(gè)確切的時(shí)間,一般先染5-10min,取出后返藍(lán),鏡下觀察,若染色不足,可延長(zhǎng)染色時(shí)間。

9、蘇木素使用一段時(shí)間后,表面易出現(xiàn)亮晶狀氧化漂浮物,必須勤過(guò)濾,否則粘附于組織上時(shí)不易去掉,蘇木素液顏色為灰藍(lán)色時(shí)應(yīng)棄掉換新液。

10、鹽酸酒精分化是蘇木素染色的關(guān)鍵,分化時(shí)間長(zhǎng)短很難確切說(shuō)出,只有憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)控制操作,分化時(shí)細(xì)胞核以外成分首先脫色,其次胞核開(kāi)始脫色,分化時(shí)應(yīng)隨時(shí)在顯微鏡下觀察,使組織著染適度,分化鮮明,一般在鹽酸酒精中將組織分化成淡粉色為宜。

11、分化適度的切片,應(yīng)立即用水沖洗,否則殘存在切片上的鹽酸酒精仍然進(jìn)行著脫色作用,沖洗時(shí)水流不宜過(guò)大,以防脫片,沖洗時(shí)間不應(yīng)少于10min。

12、為了縮短沖洗時(shí)間,可用返藍(lán)液,但必須充分水洗,否則影響伊紅的著色。

13、伊紅應(yīng)該淡染,以免喧賓奪主,應(yīng)該色彩對(duì)比適當(dāng),鮮明艷麗。

14、組織切片的脫水,透明等必須徹底,否則切片易呈云霧狀,難以鏡檢。脫水用酒精必須定期檢查更換,以保證有效濃度。

15、切片有脫落現(xiàn)象時(shí),可用0.5%稀火棉膠液防止,切片脫蠟至純酒精后,如火棉膠液浸半分鐘,取出稍干,如80%酒精中硬化火棉膠,然后入水洗,進(jìn)行染色。

0.5%火棉膠配方:

純酒精?? ?90ml

乙醚?? ?90ml

5%火棉膠液?? ?20ml