原代細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可分裂生長，但經(jīng)過有限次數(shù)的增殖后，就會停止增殖，發(fā)生衰老和死亡，因此生物學(xué)家需要不斷用組織重新進(jìn)行原代培養(yǎng)一進(jìn)行相應(yīng)研究。細(xì)胞永生化為這一問題提供了解決方案。永生化細(xì)胞來源于脫離了正常衰老死亡過程并獲得持續(xù)分裂能力的原代細(xì)胞，具有易于培養(yǎng)和傳代、均一性好等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞永生化的方法包括放射處理、端粒酶激活、病毒基因轉(zhuǎn)染、原癌基因激活或抑癌基因抑制等，而通過重組病毒感染時(shí)細(xì)胞過表達(dá)猿猴病毒SV40大T抗原或人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT基因是最常用的兩種細(xì)胞永生化方法。

猿猴病毒SV40是由大T抗原和小T抗原及相關(guān)蛋白組成的簡單的真核細(xì)胞病毒，而SV40大T抗原為細(xì)胞轉(zhuǎn)化的啟動所必需，轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型的維持需要有大T抗原的持續(xù)表達(dá)，SV40大T抗原可降低至少3種生長抑制劑(pRb、p53和SEN6)的作用,延長成纖維細(xì)胞的生命周期并促進(jìn)永生化。

端粒是位于染色體末端具有特殊功能的帽狀結(jié)構(gòu),它在維持染色體結(jié)構(gòu)和位置的穩(wěn)定性，防止化學(xué)酶降解染色體等方面具有重要的作用。端粒長度與有絲分裂次數(shù)有關(guān)，隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，端粒進(jìn)行縮短，當(dāng)縮短到一定的限度時(shí),細(xì)胞失去分裂增殖的能力,進(jìn)而衰老死亡。而端粒酶則是催化端粒自我復(fù)制并負(fù)責(zé)端粒延長的逆轉(zhuǎn)錄酶，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要生物因子，端粒酶是細(xì)胞永生化的關(guān)鍵。人hTERT（human telomerase reverse transcriptase）是端粒酶的催化亞基,與相關(guān)蛋白結(jié)合后可以激活端粒酶，延長體外細(xì)胞培養(yǎng)的生命周期，它是端粒酶的正向調(diào)控因子。利用端粒酶激活誘導(dǎo)細(xì)胞永生化是當(dāng)前細(xì)胞永生化最有效且應(yīng)用最多的方法，但是該方法可以使大多數(shù)人類或動物細(xì)胞永生化，但是對于某些細(xì)胞來說，只憑借該方法不足以使細(xì)胞永生化，還需要其他方法輔助進(jìn)行。自Bodnar等人用含hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人體正常細(xì)胞實(shí)現(xiàn)永生化后,hTERT已用于多種永生化細(xì)胞系的建株。

綜上所述，我們建議同時(shí)在細(xì)胞中導(dǎo)入hTERT和SV40 large T以提高建立永生化細(xì)胞的成功率。而以慢病毒作為載體可以高效的將導(dǎo)入hTERT和SV40 large T基因?qū)氲郊?xì)胞中，并實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，通過篩選建系，連續(xù)傳代培養(yǎng)，有望建立永生化細(xì)胞系。由于需要建立穩(wěn)定細(xì)胞系，所以需要構(gòu)建慢病毒來實(shí)現(xiàn)相關(guān)基因的穩(wěn)定表達(dá)。

漢恒生物已經(jīng)制備上述兩種建立永生化細(xì)胞系的慢病毒現(xiàn)貨，歡迎咨詢！