膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是成人最常見和最致命的原發(fā)性惡性腦腫瘤，在過去的20年里，盡管出現(xiàn)了許多新的治療方法，但除了標(biāo)準(zhǔn)療法(手術(shù)、放療和替莫唑胺)之外，膠質(zhì)母細胞瘤的臨床治療計劃仍然不可用。目前，替莫唑胺(TMZ)是延長GBM患者總生存期的化療藥物，因其烷基化DNA的能力而被報道為傳統(tǒng)療法的基石。但是，由于其高度異質(zhì)性和易突變性，它也是腫瘤耐藥性和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。因此，迫切需要確定克服TMZ阻力和提高其治療效果的更好方法。

近期，天津市環(huán)湖醫(yī)院閆華教授-佟小光教授-徐立霞副研究員團隊在Cancer Letters（IF 9.76）期刊上發(fā)表了題為“Ultrasound-excited temozolomide sonosensitization induces necroptosis”的文章。該研究首次發(fā)現(xiàn)TMZ在超聲(US)的影響下會產(chǎn)生活性氧(ROS)。這一特性使得TMZ-US療法在GBM治療中具有更好的療效。鑒于US在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病中的使用日益增多，以及TMZ對GBM治療的重要性，有助于TMZ對相關(guān)膠質(zhì)母細胞瘤治療的發(fā)展。中科新生命為該研究提供了4D Labelfree蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

?研究材料

替莫唑胺(TMZ)、人膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）細胞

?技術(shù)路線

步驟1：TMZ-US在體外增強TMZ對膠質(zhì)瘤的化療敏感性；

步驟2：TMZ-US在體內(nèi)增強抗腫瘤作用；

步驟3：差異甲基化基因和差異表達基因的綜合分析；

步驟4：TMZ-US通過增加ROS誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞的壞死凋亡；

步驟5：TMZ-US不能誘導(dǎo)線粒體依賴性細胞凋亡。

?研究結(jié)果

1. TMZ-US在體外增強TMZ對膠質(zhì)瘤的化療敏感性

在本研究中，作者采用不同濃度的TMZ聯(lián)合相同超聲處理TBD、LN229、U87、U251、TMZ耐藥的U87/R和U251/R細胞。然后比較IC50值以確定聯(lián)合治療的致敏效果。CCK-8結(jié)果提示TMZ-US顯著增加了膠質(zhì)瘤細胞的抑制率，并顯著降低了TMZ的IC50。同時，作者還檢測了細胞凋亡或壞死率和入侵能力，并觀察到TMZ-US組顯示出比US和TMZ組更高的細胞凋亡或壞死率，侵襲能力更低。ATP濃度的測定也獲得了類似的結(jié)果。研究表明，ROS在腫瘤細胞中的積累會導(dǎo)致生物分子的氧化，破壞脂質(zhì)膜和蛋白質(zhì)的完整性。因此，我們檢查了C11-BODIPY581/591的含量并在TMZ-US組中觀察到膜脂質(zhì)過氧化的顯著增加。這些結(jié)果表明，TMZ-US破壞了線粒體膜電位，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化，細胞功能受損（圖1）。

2.TMZ-US在體內(nèi)增強抗腫瘤作用

作者隨后評估聯(lián)合治療對皮下腫瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抑制作用,與TMZ組相比，使用TMZ-US治療皮下腫瘤時，觀察到腫瘤生長受到顯著的抑制。當(dāng)治療患有顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的小鼠時，TMZ-US聯(lián)合治療組的體內(nèi)改善結(jié)果顯示出比TMZ組進一步抑制腫瘤生長速率。相反，荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存曲線顯示顯著延長的存活率。因此，為了了解聯(lián)合治療的毒性作用，研究人員同時監(jiān)測了體重變化。結(jié)果表明，兩組之間的體重變化無顯著差異。此外，免疫組織化學(xué)染色顯示，TMZ-US增加了腫瘤組織中的DNA損傷(γ-H2AX)和凋亡(裂解的caspase3)，并降低了與細胞增殖和侵襲相關(guān)的多種指標(biāo)的表達，包括Ki67、MMP2和N-Cadherin，這些結(jié)果表明，TMZ-US療法增強了DNA的TMZ損傷，誘導(dǎo)了更高的凋亡和更低的侵襲性(圖2)。

3. 差異甲基化基因和差異表達基因的綜合分析

作者使用多組學(xué)分析來探討TMZ-US對膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生的影響。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析TMZ-US誘發(fā)的腫瘤死亡機制。首先，對比NC、TMZ和TMZ-US，結(jié)果識別出5005個差異。KEGG對這些差異表達基因的富集分析顯示，TNF信號通路與TMZ-US效應(yīng)關(guān)系最為密切。接下來，為了進一步研究TMZ-US療法的機制，進行了多組學(xué)分析?；赗NA-seq的KEGG結(jié)果，分析了腫瘤壞死因子(TNF)的啟動子甲基化。結(jié)果表明，與TMZ組相比，該啟動子發(fā)生了超甲基化。最后，對TMZ-US和TMZ-US的DEGs進行了綜合分析。綜合多組學(xué)分析和實驗結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)TMZ-US引起TNF-α表達水平升高，這可能與其啟動子甲基化水平降低有關(guān)。此外，也發(fā)現(xiàn)壞死凋亡得到富集（圖3）。

4. TMZ-US通過增加ROS誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞的壞死凋亡

根據(jù)綜合分析結(jié)果，探查了細胞壞死性凋亡，以確定原發(fā)性細胞損傷是否由TMZ-US引起。首先，我們使用了各種細胞死亡抑制劑來探查TMZ-US治療后的細胞死亡模式。發(fā)現(xiàn)在較高的TMZ濃度下，細胞出現(xiàn)壞死性下垂。進一步探索了聯(lián)合治療后不同抑制劑濃度對細胞的作用,Nec-1和NAC對TMZ-US誘發(fā)的細胞死亡具有劑量依賴性效應(yīng)。ROS水平升高導(dǎo)致TMZ-US誘導(dǎo)的壞死凋亡。進行Western blotting分析結(jié)果顯示，TMZ-US上調(diào)了p-RIP1、p-RIP3、p-MLKL或RIP1、RIP3、MLKL，但NAC阻止了這種上調(diào)。此外，在ATP濃度測定中也獲得了類似的結(jié)果。這些結(jié)果均表明TMZ-US激活ROS誘導(dǎo)細胞壞死凋亡(圖4)。

5. TMZ-US不能誘導(dǎo)線粒體依賴性細胞凋亡

為進一步探索TMZ-US對線粒體依賴性凋亡的影響。研究人員對細胞色素c與線粒體共定位和線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究。得出以下結(jié)論: 1、TMZ-US主要影響細胞核內(nèi)的位點；2、TMZ-US不影響與線粒體依賴性凋亡有關(guān)的蛋白；3、TMZ-US主要影響生物過程(圖5)。

?文章小結(jié)

本研究提出了TMZ對GBM的超聲動力化療。本文通過理論計算和實驗證實TMZ可能是一種超聲作用下產(chǎn)生ROS的聲敏劑。此外，TMZ-US在體內(nèi)和體外均可增強TMZ化療療效，逆轉(zhuǎn)TMZ耐藥。最終，通過多組學(xué)綜合分析并實驗驗證，TMZ-US主要通過ROS誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞的壞死凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

本文工作主要在天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)外科研究所完成。文章的第一作者分別是王釩臣（天津醫(yī)科大學(xué)研究生）、徐立霞、聞斌禮（天津醫(yī)科大學(xué)研究生）；通訊作者是閆華、佟小光、王銀松（天津醫(yī)科大學(xué)）。

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