寫在前面

????????今天推薦的是由廈門大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所王鑫教授團(tuán)隊(duì)在2019年12月16日發(fā)表于PLOS Biology（IF：8.208，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是王鑫教授，研究發(fā)現(xiàn)人科動(dòng)物特異性基因USP6作為一個(gè)新的NMDA受體調(diào)控因子，可通過(guò)去泛素化途徑調(diào)節(jié)NMDA型谷氨酸受體的降解和穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力。

研究背景

????????泛素特異性蛋白酶6是一種人類去泛素化酶，以前與智力障礙和自閉癥譜系障礙有關(guān)。盡管很多研究將 USP6 與更高的大腦功能聯(lián)系起來(lái)，但尚未研究USP6在認(rèn)知中的潛在作用。

摘要部分

????????在這里，作者報(bào)告 USP6 在誘導(dǎo)的人類神經(jīng)元中高度表達(dá)，并且USP6的神經(jīng)元特異性表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的學(xué)習(xí)和記憶。同樣，USP6 表達(dá)調(diào)節(jié)USP6轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中 N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受體 (NMDAR) 依賴的LTP（長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)）和LTD（長(zhǎng)時(shí)程抑制）。轉(zhuǎn)基因 USP6 小鼠皮層的蛋白質(zhì)組學(xué)特征揭示了 NMDAR 泛素化減弱，伴隨 USP6 過(guò)表達(dá)的 NMDAR 表達(dá)、穩(wěn)定性和細(xì)胞表面分布的升高。USP6 正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的 GluN1 表達(dá)，USP6 下調(diào)阻礙突觸后密度的局灶性 GluN1 分布，并損害源自人類胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)元的突觸功能。總之，這些結(jié)果表明USP6 增強(qiáng)了 NMDAR 穩(wěn)定性以促進(jìn)突觸功能和認(rèn)知。

研究?jī)?nèi)容

1.USP6增強(qiáng)了USP6轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶行為?

????????以前的研究表明，USP6在多種人體組織中都有表達(dá)，而在睪丸中的表達(dá)量最高。利用定量反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）分析，作者發(fā)現(xiàn)，USP6mRNA水平在分化的興奮性神經(jīng)元和中間神經(jīng)元中很高，而在ESC和星形膠質(zhì)細(xì)胞中可檢測(cè)到一些表達(dá)。?

????????為了研究與USP6在小鼠大腦中獲得功能有關(guān)的潛在影響，作者在CamK2a啟動(dòng)子（CAM-USP6）的調(diào)控下產(chǎn)生了一個(gè)表達(dá)C端血凝素（HA）標(biāo)記的人USP6的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。者觀察到轉(zhuǎn)基因USP6在大腦皮層和海馬中的表達(dá)，而在小腦中則無(wú)法檢測(cè)到它的表達(dá)。

????????鑒于USP6是一個(gè)同源的特異性基因，而且研究指出破壞USP6基因的表達(dá)與智力低下有關(guān)，USP6可能在人類的高級(jí)認(rèn)知功能中起作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者用NOR測(cè)試評(píng)估了CAM-USP6動(dòng)物和它們的WT同胞的學(xué)習(xí)和記憶，觀察到CAM-USP6轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與WT對(duì)照組相比具有更高的識(shí)別指數(shù)，且在莫里斯水迷宮任務(wù)中的空間參考記憶和反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)中表現(xiàn)更佳。

研究結(jié)論：作者構(gòu)建了人USP6的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)USP6的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了CAM-USP6小鼠的空間記憶和認(rèn)知靈活性。

2.USP6增強(qiáng)了體內(nèi)的社會(huì)互動(dòng)和超聲波發(fā)聲頻率?

????????USP6位點(diǎn)的異常遺傳中斷也與社會(huì)行為障礙有關(guān)。為了確定轉(zhuǎn)基因USP6的表達(dá)是否能影響小鼠的社會(huì)行為，作者進(jìn)行了三室試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在社會(huì)性測(cè)試試驗(yàn)中，與空籠子相比，CAM-USP6小鼠花更多時(shí)間接近 "陌生 "小鼠。

????????作者通過(guò)超聲波發(fā)聲（USV）記錄進(jìn)一步描述了CAM-USP6幼鼠的交流行為。隔離誘導(dǎo)的幼崽USV行為是一種廣泛用于描述人類疾病的小鼠模型的方法，這些疾病涉及語(yǔ)言和社會(huì)行為的缺陷。CAM-USP6幼崽在出生后第7天比WT對(duì)照組更頻繁地發(fā)聲，表明轉(zhuǎn)基因USP6的表達(dá)可以增強(qiáng)幼崽和母鼠之間的交流。

研究結(jié)論：USP6的上調(diào)能增強(qiáng)空間記憶行為以及語(yǔ)言和社會(huì)互動(dòng)的各個(gè)方面。

?

3.USP6的表達(dá)并不影響USP6轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)發(fā)育? ? ?

????????以前曾觀察到USP6的類似物TBC1D3的表達(dá)通過(guò)增加神經(jīng)祖細(xì)胞的產(chǎn)生而在大腦發(fā)育過(guò)程中誘發(fā)皮質(zhì)折疊。為了研究USP6在胚胎神經(jīng)發(fā)育中的潛在作用，作者利用Nestin啟動(dòng)子（Nestin-USP6）產(chǎn)生了表達(dá)USP6的轉(zhuǎn)基因小鼠，并與野生型小鼠的大腦皮層在各個(gè)方面進(jìn)行比較。

研究結(jié)論：與以前TBC1D3的結(jié)果相反，轉(zhuǎn)基因USP6的表達(dá)并沒(méi)有明顯改變大腦的大體解剖結(jié)構(gòu)或皮質(zhì)分層/折疊，也不會(huì)影響突觸密度和形態(tài)。

?

4.CAM-USP6小鼠顯示出增強(qiáng)的突觸功能

????????作者通過(guò)電生理記錄實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)USP6的表達(dá)對(duì)基礎(chǔ)突觸傳遞的影響很小甚至沒(méi)有。為了確定USP6的表達(dá)是否會(huì)影響CAM-USP6小鼠的突觸可塑性，作者檢查了CAM-USP6小鼠的NMDAR依賴的LTP和LTD反應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn)，與WT對(duì)照組相比，CAM-USP6的海馬CA1LTP增強(qiáng)，LTD減弱。鑒于AMPARmEPSC記錄顯示正常反應(yīng)，AMPAR功能似乎在CAM-USP6和WT小鼠中都是完整的。為了確定CAM-USP6小鼠NMDAR功能的潛在差異，作者測(cè)量了CAM-USP6小鼠和WT對(duì)照組的NMDA/AMPA比率和誘發(fā)的NMDA電流，作者觀察到海馬CAM-USP6CA1神經(jīng)元的NMDA/AMPA比率和NMDA-eEPSC幅度增加。

研究結(jié)論：USP6的表達(dá)增強(qiáng)了CAM-USP6小鼠的NMDAR依賴性突觸功能。

?

5.USP6通過(guò)其去泛素化活性穩(wěn)定NMDARs?

????????作者用生化分餾法觀察到USP6在突觸體和PSD富集部分的分布，表明USP6可能通過(guò)突觸蛋白的去泛素化影響突觸功能。因此，作者對(duì)從小鼠皮層組織中提取的胰蛋白酶消化蛋白進(jìn)行免疫純化，以獲得用二甘醇Ub標(biāo)記的肽，并比較這些二甘醇肽在CAM-USP6小鼠皮層組織和WT對(duì)照組中的相對(duì)豐度。使用這種方法，作者確定了175個(gè)蛋白質(zhì)（150個(gè)上調(diào)，25個(gè)下調(diào)）在CAM-USP6和WT小鼠大腦中不同程度地與Ub結(jié)合。

????????有趣的是，作者觀察到參與突觸功能和可塑性相關(guān)途徑的二甘醇標(biāo)記的蛋白質(zhì)富集，包括WT與CAM-USP6轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中的LTP。在小RhoGTP酶Rac家族的小GTP酶1（Rac1）以及突觸標(biāo)記（Syt）1中觀察到不同的Ub特征。作者還觀察到CAM-USP6與WT的Ub特征在突觸后成分中的差異，直接與PSD功能相關(guān)，包括PSD95和NMDAR亞單位GluN2B。

研究結(jié)論：CAM-USP6可能驅(qū)動(dòng)突觸功能的變化，以調(diào)節(jié)/增強(qiáng)記憶、認(rèn)知和社會(huì)行為。

????????接下來(lái)作者探究在CAM-USP6大腦中Ub相關(guān)蛋白質(zhì)組中確定的關(guān)鍵目標(biāo)的表達(dá)是否發(fā)生改變。通過(guò)western blot，作者觀察到CAM-USP6小鼠皮層和海馬中GluN1、GluN2A和GluN2BNMDAR亞基的上調(diào)，但GluA1和GluA2 AMPAR水平幾乎沒(méi)有差異。通過(guò)對(duì)CAM-USP6小鼠皮層的qRT-PCR分析，作者觀察到谷氨酸受體mRNA表達(dá)幾乎沒(méi)有變化，這表明NMDAR表達(dá)的差異是由于蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)。

?????????為了研究USP6的上調(diào)是否會(huì)影響NMDAR亞基在細(xì)胞表面的分布，作者對(duì)來(lái)自WT和CAM-USP6小鼠胚胎的初級(jí)神經(jīng)元進(jìn)行了細(xì)胞表面生物素標(biāo)記的試驗(yàn)。作者觀察到細(xì)胞表面GluN1的明顯上調(diào)，但AMPAR亞基GluA1或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）沒(méi)有變化，表明CAM-USP6在增強(qiáng)細(xì)胞表面NMDAR分布方面發(fā)揮了潛在作用。此外，與WT對(duì)照組相比，在CAM-USP6小鼠大腦的突觸體和PSD富集餾分中觀察到GluN1、GluN2A和GluN2B的水平增加，這些結(jié)果表明USP6在介導(dǎo)生理上的GluN1平衡和細(xì)胞表面分布方面的作用。作者隨后在表達(dá)GluN1的人類HEK293T細(xì)胞系中研究了USP6敲低的影響。作者發(fā)現(xiàn)shRNA介導(dǎo)的USP6敲低明顯降低了GluN1蛋白的表達(dá)，增加了泛素化GluN1的水平。

研究結(jié)論：NMDA受體是USP6的潛在底物。

?

6.USP6與NMDARs相互作用，減弱USP介導(dǎo)的NMDAR轉(zhuǎn)化

????????作者接下來(lái)探究USP6是否與NMDAR亞單位相互作用。從CAM-USP6小鼠腦裂解液中免疫沉淀（IP）成功地證明了USP6與NMDAR亞單位（GluN1和GluN2B）的共沉淀。作者進(jìn)一步表征了NMDAR與TBC或USP域USP6同源物（即TBC1D3和USP32）的結(jié)合；作者發(fā)現(xiàn)USP6和TBC1D3都與GluN1/GluN2B共沉淀。

研究結(jié)論：N-末端的TBC結(jié)構(gòu)域是NMDAR相互作用所必需的。

????????隨后，作者比較了WT和CAM-USP6小鼠皮層中GluN1的泛素化；使用GluN1抗體的GluN1 IP和隨后的Ub免疫印跡分析更高分子量的聚Ub結(jié)合物，證明USP6的表達(dá)降低了體內(nèi)聚泛素化GluN1的水平。此外，Ub IP和通過(guò)免疫印跡檢測(cè)GluN1表明，在CAM-USP6大腦中，GluN1與Ub共沉淀減少。在GluN1-Myc轉(zhuǎn)染的HEK293T中，shRNA介導(dǎo)的USP6敲低導(dǎo)致聚泛素化的GluN1積累。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，USP6的下調(diào)可能會(huì)增強(qiáng)Ub結(jié)合的GluN1的積累。為了確定USP6是否影響GluN1的周轉(zhuǎn)，作者在過(guò)量表達(dá)GluN1的HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了環(huán)己酮追隨試驗(yàn)；作者發(fā)現(xiàn)GluN1的降解被shRNA介導(dǎo)的USP6下調(diào)明顯加速。

研究結(jié)論：USP6可以與NMDAR亞單位相互作用，并通過(guò)減少NMDAR泛素化促進(jìn)其穩(wěn)定。

?

7.剝奪USP6會(huì)降低ESC衍生的人類興奮性神經(jīng)元中NMDAR的表達(dá)和功能

????????為了研究USP6在人類神經(jīng)元模型系統(tǒng)中的影響，作者從H9 ESCs分化出人類興奮性神經(jīng)元。為了確認(rèn)ESCs成功分化為興奮性神經(jīng)元，作者在成熟分化的神經(jīng)元中進(jìn)行了微管相關(guān)蛋白（MAP）2（樹突標(biāo)記）和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（vGluT）1（興奮性神經(jīng)元標(biāo)記）的染色。作者還通過(guò)貼片鉗記錄分化的神經(jīng)元對(duì)不斷增加的刺激的動(dòng)作電位反應(yīng)來(lái)證實(shí)成熟。為了進(jìn)一步確定USP6功能的喪失是否對(duì)ESC衍生的人類神經(jīng)元中GluN1的表達(dá)有消極的調(diào)節(jié)作用，作者使用慢病毒在分化的神經(jīng)元中轉(zhuǎn)導(dǎo)USP6靶向的shRNA。USP6的敲除明顯減少了樹突狀GluN1點(diǎn)的形成和GluN1/PSD95點(diǎn)的共定位。此外，shRNA介導(dǎo)的USP6下調(diào)減少了mEPSC頻率，但對(duì)誘導(dǎo)的人類興奮性神經(jīng)元的mEPSC影響很小。

研究結(jié)論：USP6的下調(diào)可以減少GluN1在PSD的聚集/分布，并損害ESC衍生的人類神經(jīng)元模型的mEPSC頻率。

USP6 在 PSD 處去泛素化 NMDAR，從而促進(jìn) NMDAR 的穩(wěn)定，進(jìn)而增加 NMDAR 功能和突觸活動(dòng)并增強(qiáng)認(rèn)知。

?

結(jié)論與討論

????????作者構(gòu)建了USP6過(guò)表達(dá)小鼠模型，人類USP6在大腦皮層和海馬內(nèi)的興奮性神經(jīng)元中特異性表達(dá)。USP6轉(zhuǎn)基因小鼠在莫里斯水迷宮(MWM)和新物體識(shí)別(NOR)測(cè)試中表現(xiàn)出增強(qiáng)的學(xué)習(xí)和記憶行為。此外，轉(zhuǎn)基因USP6表達(dá)增加了小鼠大腦中的突觸功能和NMDAR表達(dá)。與USP6功能獲得的認(rèn)知增強(qiáng)一致，人胚胎干細(xì)胞(ESC)衍生神經(jīng)元中shRNA介導(dǎo)的USP6敲減降低了NMDAR的表達(dá)和功能。作者還發(fā)現(xiàn)USP6與NMDAR結(jié)合并使其去泛素化，從而增強(qiáng)NMDAR穩(wěn)定性?？傊髡邔SP6鑒定為NMDAR的新型特異性調(diào)節(jié)劑, USP6通過(guò)翻譯后穩(wěn)態(tài)機(jī)制增強(qiáng)NMDAR穩(wěn)定性，其調(diào)節(jié)可以影響突觸活動(dòng)和記憶形成。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000525