誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cell，iPS），是一種由哺乳動(dòng)物成體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子等手段脫分化形成的多能干細(xì)胞，最早由日本學(xué)者山中伸彌的研究團(tuán)隊(duì)于2006年發(fā)現(xiàn)。誘導(dǎo)方法是通過慢病毒載體將Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4四種轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)入小鼠成體細(xì)胞將其轉(zhuǎn)化為類似于胚胎干細(xì)胞的多能干細(xì)胞。2007年，iPS誘導(dǎo)技術(shù)成功應(yīng)用于人體細(xì)胞。其后，研究人員又不斷優(yōu)化誘導(dǎo)方法，如使用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染、腺病毒感染、合成?RNAs和蛋白質(zhì)等無外源基因整合風(fēng)險(xiǎn)的方法，提高iPS應(yīng)用的安全性。

iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ES）擁有相似的再生能力，理論上可以分化為成體的所有器官、組織或細(xì)胞，在很大程度上解決了神經(jīng)、心肌等細(xì)胞難獲取的問題。而相比ES，iPS細(xì)胞來源廣取材方便，且不用破壞胚胎，所面臨的倫理道德爭(zhēng)議較小。不僅如此，患者自身來源的iPS還可以規(guī)避細(xì)胞移植出現(xiàn)排異反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，因此iPS細(xì)胞在一定程度上沖擊了ES的地位，被認(rèn)為在再生醫(yī)學(xué)、新藥開發(fā)、疾病模型構(gòu)建等方面有更廣泛的應(yīng)用前景。

然而，iPS作為疾病模型存在一個(gè)問題，那就是無法很好地區(qū)分疾病表型的產(chǎn)生是僅由目標(biāo)基因突變導(dǎo)致，還是由不同個(gè)體遺傳背景和環(huán)境因素差異造成的。為了克服這個(gè)問題，研究人員通過基因編輯技術(shù)與iPSC聯(lián)用創(chuàng)建等基因模型（即遺傳背景相同）來嚴(yán)格設(shè)置對(duì)照，很好地排除了點(diǎn)突變以外的干擾因素。具體方法是對(duì)患者來源的iPSC進(jìn)行突變修復(fù)，觀察誘導(dǎo)分化后疾病表型是否消失，或?qū)⒄Ｈ藖碓吹膇PSC進(jìn)行突變，觀察誘導(dǎo)分化后疾病表型是否出現(xiàn)。而CRISPR/Cas9作為近年來最主流的基因編輯技術(shù)，有著效率高、操作簡(jiǎn)單和成本低的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于iPS相關(guān)的基因敲除、點(diǎn)突變和敲入，下面就給大家分享幾個(gè)應(yīng)用案例。

疾病建模：常染色體顯性多囊腎病iPSC模型構(gòu)建

常染色體顯性多囊腎病?(ADPKD) 是最常見的遺傳性腎病，發(fā)病率大約為1/400人-1/1000人?；加羞@種疾病的人大約有一半將會(huì)發(fā)展為終末期腎臟疾病，需要進(jìn)行透析或腎移植。常染色體顯性多囊腎和兩個(gè)基因缺陷有關(guān)，其中85％的患者是由位于16號(hào)染色體的基因PKD1（TRPP1）發(fā)生突變所致。Romano等通過使用CRISPR-Cas9技術(shù)在PKD1基因中產(chǎn)生了雜合敲除與純合敲除的等基因iPS細(xì)胞系。并驗(yàn)證了敲除后的iPS細(xì)胞在三個(gè)胚層中保持干細(xì)胞樣形態(tài)、正常核型、多能性和分化能力?？梢宰鳛檠芯?ADPKD致病機(jī)制以及藥物篩選的模型資源[1]。

基因矯正：患者iPS基因矯正后恢復(fù)了β-珠蛋白(HBB)表達(dá)

β-地中海貧血是一種單基因疾病，由β-珠蛋白 (?HBB?) 基因點(diǎn)突變或片段缺失導(dǎo)致正常β珠蛋白肽鏈缺失或合成量不足引起的。β-地中海貧血攜帶者在中國(guó)南方的患病率為 2.54%，幾十年來一直威脅著數(shù)百萬人的生命。目前，造血干細(xì)胞移植是重度β-地中海貧血患者唯一可用的根治性治療方法。然而，造血干細(xì)胞移植受限于大多數(shù)患者缺乏HLA匹配的健康供體。隨著基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究人員通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)患者來源的iPS細(xì)胞（基因型為homozygous 41/42 deletion）進(jìn)行基因編輯，主要設(shè)計(jì)了靶向HBB突變位置的gRNA，同時(shí)以包含正常序列（WT）的PCR產(chǎn)物作為Donor模板進(jìn)行重組，篩選到基因矯正成功的細(xì)胞。將矯正成功的iPS細(xì)胞重新分化為造血干細(xì)胞HSCs，再將HSCs移植到受輻射的NSI免疫缺陷鼠上，最終發(fā)現(xiàn)移植了矯正iPS后的小鼠體內(nèi)可以正常造血，并產(chǎn)生正常的HBB蛋白，這項(xiàng)研究也為β-地中海貧血的治療帶來新的希望[2]。

抗病毒治療：iPSC及其衍生血細(xì)胞敲除CCR5后具有HIV抗性

趨化因子受體5（CCR5）作為HIV病毒的共同受體，對(duì)于CCR5嗜性病毒的細(xì)胞感染至關(guān)重要，研究表明，CCR5功能性喪失可防止HIV感染。通過對(duì)病人體內(nèi)的免疫細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，有望對(duì)HIV感染的患者進(jìn)行治療，但由于免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低，培養(yǎng)及擴(kuò)增難度較大，難以直接對(duì)其進(jìn)行基因編輯。Kang等通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)，在iPSC上進(jìn)行了基因編輯，分別設(shè)計(jì)靶向CCR5的單gRNA敲除方案和雙gRNA敲除方案，成功篩選到CCR5敲除純合克隆。純合CCR5突變的iPSC細(xì)胞系仍然顯示出多能干細(xì)胞的典型特性，并有效分化為造血細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，體外HIV感染實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)CCR5嗜性病毒的攻擊產(chǎn)生了獨(dú)特的抗性。這項(xiàng)研究表明將iPSC技術(shù)與CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合，在HIV感染的治療中有應(yīng)用前景[3]。

其實(shí)，CRISPR基因編輯與iPS聯(lián)合用于疾病模型構(gòu)建和細(xì)胞治療的案例還有很多，包括神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病和心臟遺傳病等，以下表格匯總了往年的一些相關(guān)研究[4]。

表1：CRISPR基因編輯與iPS結(jié)合研究案例

看到這么多案例，你是不是也心動(dòng)了？先別急，iPS基因編輯細(xì)胞構(gòu)建可沒那么簡(jiǎn)單：iPS細(xì)胞培養(yǎng)較為復(fù)雜，稍有不慎可能會(huì)造成細(xì)胞分化而失去干性，因而構(gòu)建過程需要更小心謹(jǐn)慎，耗時(shí)也較長(zhǎng)；另外iPS的轉(zhuǎn)染和單克隆篩選也比較困難，需要一定的經(jīng)驗(yàn)和耐心。源井生物擁有豐富的iPS細(xì)胞基因編輯經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)毫無障礙，對(duì)于不同來源的iPS細(xì)胞至少測(cè)試3種轉(zhuǎn)染方案確保轉(zhuǎn)染效率，加上獨(dú)特的EZ-editorTM單克隆鑒定技術(shù)，快速實(shí)現(xiàn)高通量陽性克隆篩選，讓iPS基因編輯變得更簡(jiǎn)單！

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參考文獻(xiàn)：

[1]?Romano E, Trionfini P, Ciampi O, et al. Generation of PKD1 mono-allelic and bi-allelic knockout iPS cell lines using CRISPR-Cas9 system[J]. Stem Cell Research, 2020, 47: 101881.

[2]?Ou Z, Niu X, He W, et al. The combination of CRISPR/Cas9 and iPSC technologies in the gene therapy of human β-thalassemia in mice[J]. Scientific reports, 2016, 6(1): 1-13.

[3]?Kang H J, Minder P, Park M A, et al. CCR5 disruption in induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9 provides selective resistance of immune cells to CCR5-tropic HIV-1 virus[J]. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2015, 4: e268.

[4]?Ben Jehuda R, Shemer Y, Binah O. Genome editing in induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9[J]. Stem Cell Reviews and Reports, 2018, 14(3): 323-336.