哺乳動物腸上皮的快速周轉(zhuǎn)和再生由定位于腸隱窩的腸道干細胞(ISCs)支持，這些細胞向上遷移并分化為腸細胞、簇毛細胞、杯狀細胞或腸內(nèi)分泌細胞[1]。在再生過程中，組織模式和內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到多種信號通路調(diào)控，包括Wnt，Notch和BMP等。雖然維持干細胞功能和隱窩穩(wěn)態(tài)的信號通路需求已經(jīng)得到了很好的研究，但ISCs自我更新能力的潛在機制仍有待進一步探索。

環(huán)狀RNA (circRNAs)由親代基因的外顯子或內(nèi)含子通過反向剪接而成。由于circRNA的高穩(wěn)定性，它們可以在特定的細胞類型中以一種臨時調(diào)節(jié)的方式積累[2]。而針對ISCs，有報道circPan3可通過小位ILC2s產(chǎn)生的IL-13促進ISCs的自我更新，而更多的機制研究有待進一步發(fā)現(xiàn)。

2023年1月，中國科學院生物物理研究所范祖森教授在The EMBO Journal發(fā)表文章：Noncoding RNA circBtnl1 suppresses self-renewal of intestinal stem cells via disruption of Atf4 mRNA?stability。作者發(fā)現(xiàn)了一種在ISCs中高度表達的circRNA—circBtnl1。circBtnl1的缺失增強了小鼠ISCs的自我更新能力和上皮再生，而其親本基因Btnl1的mRNA和蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化。ATF4可通過獨特的基序與Sox9啟動子結(jié)合，激活了Sox9的轉(zhuǎn)錄，增強了ISCs的自我更新能力和上皮再生。在機制上，circBtnl1可與Atf4 mRNA競爭性結(jié)合ATP依賴的RNA解旋酶Ddx3y，損害Atf4 mRNA在野生型ISCs中的穩(wěn)定性，抑制ISCs的活性。這表明circBtnl1介導的Atf4 mRNA衰變抑制了Sox9轉(zhuǎn)錄，從而負向調(diào)節(jié)了ISCs的自我更新機制。

1、CircBtnl1在腸干細胞中高度表達

為了探索circRNA在ISCs中的作用，作者從C57BL/6小鼠中分離出小腸隱窩，并進行高通量circRNA-seq。然后，在小鼠ISCs中選擇了前8個高表達的circRNA (circOgdh, circRasa2a, circBtnl1, circMed13I, circVapa, circSlc43a2, circCnot6I, circAlg12)，均做了背靠背引物設(shè)計驗證成環(huán)，RNase R和放線菌素D驗證它們的穩(wěn)定性。接下來，作者在ISCs中使用shRNA分別敲低這8種circRNA，并建立了類器官分析來確定它們的損失對ISCs活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低circBtnl1最顯著地誘導了類器官的形成。

許多circRNA表現(xiàn)出組織特異性的表達模式，這意味著它們在各種組織中具有特定的功能。

接下來，作者評估了circBtnl1在ISCs中的功能。敲低circBtnl1顯著破壞了小腸和結(jié)腸的類器官形成能力。FISH檢測了circBtnl1在小鼠各組織中的表達，作者發(fā)現(xiàn)circBtnl1在各組織中廣泛表達，其中小腸、結(jié)腸和胃是高表達的前三個組織；并且circBtnl1僅定位于腸隱窩和小腸類器官的細胞質(zhì)中，核-細胞質(zhì)分離實驗也驗證了這一結(jié)果。這些結(jié)果表明circBtnl1在小鼠ISCs中高表達。

2、CircBtnl1基因敲除促進了ISCs的自我更新

為了確定circBtnl1在調(diào)節(jié)ISCs中的生理作用，作者用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建circBtnl1敲除小鼠模型。作者發(fā)現(xiàn)circBtnl1敲除小鼠相比對照組小鼠腸道長度、隱窩數(shù)量及細胞數(shù)量增加；Ki67和EdU染色檢測circBtnl1敲除促進小鼠ISCs的增殖。提示circBtnl1敲除促進ISCs的增殖。

3、CircBtnl1在ISCs中與Ddx3y結(jié)合

鑒于circBtnl1的缺失不會改變其親本基因的mRNA和蛋白水平，circBtnl1可以通過其他途徑調(diào)節(jié)ISCs的自我更新，比如發(fā)揮RBP功能。為了鑒定circBtnl1的結(jié)合蛋白候選位點，作者在小鼠ISCs裂解液中進行了RNA pulldown和質(zhì)譜測定。Ddx3y被確定為相關(guān)的候選蛋白。Ddx3y是一個依賴于ATP的RNA解旋酶。此外，RNA-FISH和免疫熒光實驗證實circBtnl1與Ddx3y在小鼠小腸隱窩和ISCs類器官的細胞質(zhì)中共定位。

通過RNA pulldown和WB分析進一步驗證了circBtnl1與Ddx3y的相互作用。通過Uniprot網(wǎng)站分析，Ddx3y中有兩個RNA結(jié)合位點，表明Ddx3y可以作為RNA結(jié)合點。體外測圖發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag標記的Ddx3y蛋白的RNA結(jié)合域?qū)ζ渑ccircBtnl1的相互作用至關(guān)重要。片段映射分析亦發(fā)現(xiàn)，circBtnl1轉(zhuǎn)錄本(HR2)的外顯子4與Ddx3y蛋白結(jié)合是必要的。這些結(jié)果提示circBtnl1在小鼠ISCs中主要定位于細胞質(zhì)，并與Ddx3y蛋白相互作用。

作者發(fā)現(xiàn)，過表達Ddx3y顯著促進了組織腔形成能力。而circbtnl1則逆轉(zhuǎn)Ddx3y過表達在類器官中的作用。Ki67染色檢測小腸類器官的結(jié)果與上述結(jié)果一致。此外，circBtnl1在類器官形成和增殖中的作用可以受Ddx3y反向調(diào)控，這表明circBtnl1在ISCs中通過Ddx3y發(fā)揮作用。

4、CircBtnl1和Atf4 mRNA競爭性結(jié)合Ddx3y，調(diào)節(jié)Atf4 mRNA的穩(wěn)定性

為了進一步鑒定circBtnl1的靶基因，作者對模型小鼠的Lgr5+ ISCs進行了轉(zhuǎn)錄組微陣列分析。經(jīng)過重重篩選，作者觀察到Atf4下調(diào)后，類器官形成效果最差，提示Atf4對ISC活性的正向調(diào)控作用。而巧合的是，Atf4 mRNA能夠與Ddx3y相互作用。而過表達circBtnl1則破壞Atf4 mRNA與Ddx3y的相互作用。接下來，作者確定Ddx3y和circBtnl1是否結(jié)合在Atf4 mRNA的同一位點上。正如預期的那樣，WB證實Atf4 mRNA與Ddx3y的相互作用呈劑量依賴性；截斷作圖顯示Atf4 mRNA與Ddx3y的相互作用位點與circBtnl1相同，提示CircBtnl1和Atf4可競爭性結(jié)合Ddx3y。敲除circBtnl1后，ISCs Atf4 mRNA的穩(wěn)定性增強，表明circBtnl1負向調(diào)節(jié)Atf4 mRNA的穩(wěn)定性。

為了確定Ddx3y在ISCs自我更新中的作用，作者發(fā)現(xiàn)在circBtnl1敲除的小鼠類器官中，Ddx3y敲除顯著降低ATF4的表達，而過表達Ddx3y的結(jié)果相反，提示Ddx3y正向調(diào)控ATF4的表達。但值得注意的是，無論是在哪種模型小鼠上，Atf4敲除顯著減少了ISCs形成類器官的能力。綜上所述，circBtnl1缺失使得Ddx3y釋放，從而促進Atf4 表達。

5、CircBtnl1敲除可促進ATF4進入Sox9啟動子，觸發(fā)其轉(zhuǎn)錄

作者進一步確定ATF4在下游靶基因調(diào)控中的生物學功能。通過Homer實驗預測了小鼠(向上)和人類(向下)Sox9啟動子中預測的ATF4-結(jié)合基序。發(fā)現(xiàn)ATF4在Sox9啟動子的100 ~ 200 bp區(qū)域富集。雙熒光素酶報告實驗也發(fā)現(xiàn)了Sox9啟動子缺失顯著降低ATF4介導的Sox9熒光素酶活性。Sox9可促進ISCs自我更新。

circBtnl1缺陷始終導致Sox9 mRNA轉(zhuǎn)錄升高。在circBtnl1敲除類器官中，敲低Atf4顯著降低Sox9表達；相比之下，過表達circBtnl1可抑制Sox9的表達。這些數(shù)據(jù)表明，Sox9在ISC自我更新維持調(diào)控中作為ATF4的下游靶點。綜上所述，circBtnl1的缺失促進了ATF4的表達，從而增強了ISCs中Sox9的轉(zhuǎn)錄。

6、Sox9基因敲除會損害ISCs的自我更新

為了進一步驗證Sox9在ISCs自我更新維持中的生理作用，作者通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Sox9缺陷小鼠(circBtnl1+/+；sgSox9和Circbtnl1-/-；sgSox9)。在circBtnl1+/+中，sgSox9顯著降低，同時ISC標記物Olfm4也隨之降低。如預期的那樣，Sox9缺失導致circBtnl1+/+小鼠小腸和結(jié)腸中Ki67+ISC亞群數(shù)量顯著減少。此外，在circBtnl1+/+和Circbtnl1-/-小鼠中，Sox9缺失導致小腸組織中隱窩數(shù)量減少。作者隨后檢測了Sox9缺失小鼠的腸道再生情況，發(fā)現(xiàn)在輻射誘導腸上皮損傷后，circBtnl1+/+和Circbtnl1-/-小鼠中，Sox9缺失導致腸再生受損。與此一致，作者發(fā)現(xiàn)circBtnl1+/+和circBtnl1-/-類器官中Sox9的缺失顯著抑制類器官的形成。這些數(shù)據(jù)表明Sox9參與circBtnl1介導的ISCs自我更新。

原文鏈接：

10.15252/embj.2022112039

參考文獻：

[1]?Yan KS, Janda CY, Chang J, Zheng GXY, Larkin KA, Luca VC, Chia LA, Mah AT,?Han A, Terry JM et al (2017) Non-equivalence of Wnt and R-spondin?ligands during Lgr5(+) intestinal stem-cell self-renewal. Nature 545:238–242

[2]?Vo JN, Cieslik M, Zhang Y, Shukla S, Xiao L, Zhang Y, Wu YM, Dhanasekaran SM, Engelke CG, Cao X et al (2019) The landscape of circular RNA in?cancer. Cell 176: 869–881.e13

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