圖1. lncRNA功能

由于lncRNA發(fā)現(xiàn)較晚，功能研究不完善，因此，我們可以以mRNA為橋梁對(duì)lncRNA的功能進(jìn)行推斷和研究。通常將lncRNA的功能分成cis和trans兩種（圖2）。Cis作用的原理是lncRNA的功能與其臨近mRNA相關(guān)，可以以lncRNA基因組坐標(biāo)上下游100 kb的mRNA作為lncRNA的靶基因進(jìn)行研究。而trans作用的原理是lncRNA與其共表達(dá)的mRNA相關(guān)，可以根據(jù)表達(dá)量計(jì)算相關(guān)性以預(yù)測lncRNA的靶基因（一般要求樣品數(shù)超過6個(gè)），從而研究lncRNA的功能。

圖2. Cis vs trans

相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient）

相關(guān)系數(shù)用來衡量兩個(gè)變量X和Y間的相關(guān)性。相關(guān)性包括：線性相關(guān)和非線性相關(guān)。

Pearson相關(guān)系數(shù)用來衡量兩個(gè)變量X和Y之間的線性相關(guān)關(guān)系。常用r表示，取值范圍為[-1,1]。其中負(fù)的表示負(fù)相關(guān)，正的表示正相關(guān)。值越大相關(guān)性越強(qiáng)。

而spearman秩相關(guān)系數(shù)用來衡量兩個(gè)變量間的非線性相關(guān)關(guān)系。是一個(gè)非參數(shù)度量。常用rho（ρ）來表示。取值范圍也是[-1,1]。

常見的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)為：不相關(guān)：0-0.1 ；低相關(guān)：0.1-0.3；中等相關(guān)：0.3-0.5；顯著相關(guān)0.5-1.0。應(yīng)參考具體使用場景進(jìn)行判斷。

雖然pearson相關(guān)系數(shù)最常用，然而它受數(shù)據(jù)分布的影響，對(duì)異常值敏感，需要數(shù)據(jù)服從近似正態(tài)分布才能使用。然而，我們遇到的數(shù)據(jù)是非常復(fù)雜的，往往并不符合線性相關(guān)，因此，越來越多的研究者使用spearman秩相關(guān)系數(shù)（Spearman’s rank correlation coefficient）計(jì)算兩個(gè)變量間的相關(guān)性。注意：相關(guān)性不隱含因果關(guān)系。

在lncRNA-mRNA共表達(dá)相關(guān)系數(shù)計(jì)算中，pearson相關(guān)系數(shù)和spearman相關(guān)系數(shù)都有使用。例如在《Genome-wide analysis of lncRNAs, miRNAs, and mRNAs forming a prognostic scoring system in esophageal squamous cell carcinoma》文章中，作者寫道“The correlation between prognostic lncRNA and mRNA expression profiles was analyzed by Spearman method, and the lncRNA-mRNAs pairs that the absolute value of correlation coefficients > =0.4 and p < 0.05 were selected to construct the co-expression network”，使用的是Spearman相關(guān)系數(shù)，rho閾值0.4，pvalue閾值0.05。而在《Genome-wide analysis of differentially expressed lncRNAs and mRNAs in primary gonadotrophin adenomas by RNA-seq》文章中，作者寫道“The network is based on Pearson correlation coefficient (the absolute value of PCC ≥ 0.80, p-value < 0.001)”，使用的是pearson相關(guān)系數(shù)，r閾值0.8，pvalue閾值0.001。

今天，我們來計(jì)算相關(guān)系數(shù)，并使用cytoscape軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1，打開相關(guān)系數(shù)計(jì)算頁面

首先，使用瀏覽器（推薦chrome或者edge）打開lncRNA-mRNA pearson、spearman相關(guān)系數(shù)計(jì)算頁面。左側(cè)為常見作圖導(dǎo)航，中間為數(shù)據(jù)輸入框和可選參數(shù)，右側(cè)為描述和結(jié)果示例。

http://www.bioinformatics.com.cn/basic_lncrna_mrna_pearson_spearman_coexpression_analysis_t013

圖3.相關(guān)系數(shù)計(jì)算頁面

2，示例數(shù)據(jù)

點(diǎn)擊右側(cè)“示例數(shù)據(jù)”鏈接下載excel格式的示例數(shù)據(jù)。

示例數(shù)據(jù)（僅供參考）分兩部分，上半部分是lncRNA表達(dá)量，下半部分是mRNA表達(dá)量。其中行是基因，列是樣品名。LncRNA和mRNA的樣品名順序必需保持一致。

圖4.輸入數(shù)據(jù)

注意：需要參考示例數(shù)據(jù)，在excel中將自己的數(shù)據(jù)整理成示例數(shù)據(jù)的樣式，每個(gè)cell都需要有數(shù)據(jù)，不能有空的單元格。

3，粘貼示例數(shù)據(jù)

拷貝示例數(shù)據(jù)中上半部分的lncRNA數(shù)據(jù)，粘貼到第一個(gè)輸入框?？截愂纠龜?shù)據(jù)中下半部分的mRNA數(shù)據(jù)，粘貼到第二個(gè)輸入框。

圖5. 將數(shù)據(jù)粘貼到輸入框

注意：不是拷貝excel文件，是拷貝excel文件里邊的數(shù)據(jù)。另外粘貼到輸入框后，格式亂了沒關(guān)系，只要在excel中是整齊的就行。并且數(shù)據(jù)矩陣中不能有空的單元格，中文字符等。

4，修改參數(shù)，并提交

我們設(shè)置了數(shù)據(jù)是否轉(zhuǎn)化、相關(guān)系數(shù)算法等參數(shù)。由于示例數(shù)據(jù)來自芯片，因此這里不轉(zhuǎn)化。使用pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

圖6. 可選參數(shù)

5，提交分析

粘貼好輸入數(shù)據(jù)，調(diào)整好參數(shù)后，點(diǎn)擊提交按鈕，3秒鐘后，會(huì)在頁面右側(cè)出現(xiàn)結(jié)果。

圖7.結(jié)果說明及下載

結(jié)果以excel存儲(chǔ)。

圖8. 相關(guān)系數(shù)結(jié)果

各列說明：

LncRNA：lncRNA名字

mRNA：mRNA名字

r：pearson相關(guān)系數(shù)

pvalue：p值

flag：+：正相關(guān)，-：負(fù)相關(guān)

6. 過濾結(jié)果

下載結(jié)果后，使用excel的篩選功能進(jìn)行過濾，這里以p<0.05，|r|>=0.4的lncRNA-mRNA對(duì)繪制共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（帶header共28行）。

圖9. 相關(guān)系數(shù)過濾

圖10. P值過濾

7，導(dǎo)入cytoscape

拷貝這28行數(shù)據(jù)，粘貼到一個(gè)txt文件中。然后打開cytoscape軟件，導(dǎo)入這個(gè)txt文件。在彈出的窗口中選擇source和target。

圖11.導(dǎo)入txt

圖12. 選擇source和target，其中l(wèi)ncRNA為source，mRNA為target

圖13. 默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)圖

8. 網(wǎng)絡(luò)圖美化

經(jīng)過對(duì)顏色，節(jié)點(diǎn)形狀，線型，布局等的簡單美化后，獲得最終的lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖（圖12）。由于每個(gè)人的審美不同，因此這里需要花費(fèi)大量的時(shí)間進(jìn)行美化，有些研究者還會(huì)使用AI等軟件給網(wǎng)絡(luò)圖添加背景色等進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖14. 簡單美化后的網(wǎng)絡(luò)圖

微生信助力高分文章，用戶64000+，引用800+