? ? ?最近，小伙伴們經(jīng)常會(huì)問到關(guān)于Annexin V的問題，百螢把這些問題整理了出來，現(xiàn)在，請(qǐng)大家跟著百螢一起走進(jìn)Annexin V的世界吧！

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1.問：Annexin V和TUNEL有什么區(qū)別？

解 答：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標(biāo)記 (TUNEL) 是一種染色方法，用于識(shí)別細(xì)胞內(nèi) DNA 片段化位點(diǎn)——晚期細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性特征。 它使用酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 將修飾的 dNTP（例如 dUTP）連接到片段化 DNA 鏈的 3'-羥基末端。 dNTPs 通常用熒光團(tuán)修飾以促進(jìn)量化和/或可視化。

? ? ? ? Annexin V 染色通過結(jié)合由于細(xì)胞膜不對(duì)稱性喪失而暴露在細(xì)胞外的 PS 殘基來識(shí)別細(xì)胞凋亡的早期階段。 Annexin V 通常用 FITC 等熒光團(tuán)標(biāo)記，以促進(jìn)凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。

2.問：什么是Annexin V的陽性對(duì)照？

?解 ?答：Annexin V陽性對(duì)照是使用已知的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞。 當(dāng)用Annexin V 偶聯(lián)物（例如膜聯(lián)蛋白 V-FITC）染色時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生陽性信號(hào)。 例如，細(xì)胞凋亡可通過在 55°C 下加熱細(xì)胞 20 分鐘或處理已知可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞試劑（如喜樹堿或星形孢菌素）來誘導(dǎo)。

3.問：Annexin V是什么顏色的？

?解 答：就其本身而言，Annexin V 是無色的且難以檢測(cè)。 為了檢測(cè)Annexin V 與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合，Annexin V 通常與異硫氰酸熒光素 (FITC) 結(jié)合，F(xiàn)ITC 是一種綠色熒光化合物，激發(fā)峰為 491 nm，發(fā)射峰為 516 nm。 用 FITC 或任何其他綠色熒光染料標(biāo)記Annexin V，例如 iFluor 488（Ex/Em = 491/516 nm）。

4.問：什么是Annexin V結(jié)合緩沖液？

?解 答：在實(shí)驗(yàn)樣品中，Annexin V結(jié)合緩沖液能夠促進(jìn)Annexin V與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合。這些結(jié)合緩沖液需要含有足夠高濃度的鈣，使Annexin V與PS結(jié)合，但不能高到與其他磷脂結(jié)合。Annexin V結(jié)合緩沖液也可用于洗滌樣品，使其不含過量的膜聯(lián)蛋白和其他化學(xué)殘留物質(zhì)，以確保檢測(cè)。染色前，應(yīng)將細(xì)胞重懸于濃度為1x10^6/ml的Annexin V結(jié)合緩沖液中。

5.問:Annexin V是怎樣工作的？

?解 答: ?Annexin V 通過結(jié)合暴露在細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS) 殘基來識(shí)別正在發(fā)生凋亡的細(xì)胞。 在活的健康細(xì)胞中，PS 殘基位于質(zhì)膜的內(nèi)層，在那里它們無法與膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合。 當(dāng)細(xì)胞啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡（細(xì)胞凋亡）時(shí)，它們的質(zhì)膜會(huì)失去不對(duì)稱性。 PS 殘基從膜的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到外部小葉，在那里它們可以與膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合。 Annexin V 通常與熒光團(tuán)（如 FITC）結(jié)合，以促進(jìn)凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。

6.問：Annexin V陽性是什么意思？

?解 答：Annexin V陽性結(jié)果表明細(xì)胞處于凋亡的早期狀態(tài)，該術(shù)語通常用于Annexin V/PI檢? ? ? ? ? ? ? ? ?測(cè)，通過根據(jù)細(xì)胞群的健康狀況來區(qū)分細(xì)胞群。詳情如下：

? ? ? ? ? ? ? （1）Annexin V 陰性/PI陰性：說明細(xì)胞很健康。

? ? ? ? ? ? ? （2）Annexin V 陽性/PI陽性：說明該細(xì)胞處于壞死或凋亡晚期。

7.問:Annexin V染色后，能否進(jìn)行細(xì)胞固定?

?解 答: 可以，細(xì)胞可以在Annexin V染色后進(jìn)行固定操作。如果需要固定細(xì)胞，請(qǐng)滿足以下? ? ? ? ? ? ? ? ? 三個(gè)條件：

? ? ? ? ? ? （1）使用不含酒精的醛類固定。

? ? ? ? ? ? （2）請(qǐng)使用含有CaCl2的緩沖液。

? ? ? ? ? ? （3）避免使用洗滌劑或表面活性劑。

注意事項(xiàng)：在Annexin V染色前，千萬不要固定細(xì)胞，固定細(xì)胞會(huì)殺死細(xì)胞，而Annexin V染色只能在活細(xì)胞或組織上進(jìn)行。

8.問:什么是Annexin V/PI測(cè)定？

?解 答: ?Annexin V/PI測(cè)定用于通過annexin V標(biāo)記區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和通過丙碘胺（PI）標(biāo)記區(qū)分壞死/死亡細(xì)胞。在早期凋亡階段，細(xì)胞膜開始失去不對(duì)稱性，導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸（PS）轉(zhuǎn)位到膜的外表面，在此處annexin V共軛物可以檢測(cè)到它。然而，在細(xì)胞膜破裂的情況下，例如壞死，annexin V共軛物可以進(jìn)入并結(jié)合內(nèi)層膜中的PS殘基，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此，建議使用不透過細(xì)胞膜的核染料（如PI）與annexin V共軛物一起使用。這使用戶可以區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（annexin V染色）、晚期凋亡細(xì)胞（annexin V和PI染色）和壞死細(xì)胞（僅PI染色）。

9.問：Annexin V能染色壞死細(xì)胞嗎？

?解 答：是的，Annexin V可以染色壞死細(xì)胞。壞死是指不正常的細(xì)胞死亡，可能由各種事件觸發(fā)，包括組織缺血和缺氧或細(xì)胞區(qū)域的急性損傷。壞死細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵特征是質(zhì)膜破裂。這個(gè)事件使得Annexin V可以進(jìn)入整個(gè)質(zhì)膜，包括PS殘基存在的內(nèi)葉片，導(dǎo)致假陽性。因此，建議使用細(xì)胞不滲透染料（例如丙碘錠或7-AAD）與Annexin V結(jié)合物相結(jié)合，以消除假陽性并區(qū)分凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。圖中使用Annexin V將凋亡細(xì)胞染成綠色，使用7-AAD將壞死細(xì)胞染成紅色。

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