前幾期干貨為大家介紹了組織特異性表達(dá)調(diào)控，其中涉及到了重組酶系統(tǒng)，本期小編將為大家插播介紹“Cre/Loxp及其相關(guān)重組酶系統(tǒng)”。

Cre-LoxP系統(tǒng)是一種重組酶系統(tǒng)，能在DNA特定位點上執(zhí)行刪除、插入、易位及倒位，是一種廣泛應(yīng)用的基因編輯工具，可以達(dá)到在基因水平上對生物體進(jìn)行定向遺傳改造的目的，在真核和原核系統(tǒng)中均適用。

Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一種重組酶，1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，基因編碼區(qū)序列全長1029bp，編碼由343個氨基酸組成的38kDa單體蛋白。Cre重組酶不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的DNA序列，即Loxp位點，介導(dǎo)Loxp位點間的基因序列刪除或重組。

LoxP（locus of X-over P1）來源于噬菌體P1，是一段長度為34bp的DNA序列，由兩個13bp的反向重復(fù)序列和一個不對稱的8bp間隔區(qū)共同組成。反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識別和結(jié)合區(qū)域，而間隔區(qū)域決定了LoxP位點的方向。

其序列如下：

（N 表示堿基可能發(fā)生變化）

圖1 Cre-LoxP基本作用原理

一、Cre-LoxP系統(tǒng)基本作用方式

一般而言，當(dāng)細(xì)胞基因組內(nèi)存在兩個LoxP位點時，Cre重組酶會誘導(dǎo)兩個LoxP位點間的序列發(fā)生重組。重組的結(jié)果取決于兩個LoxP位點的方向，主要有以下幾種可能：?

1、如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個LoxP位點間的序列翻轉(zhuǎn)；

2、如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，并且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；

3、如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位；

4、如果四個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導(dǎo)LoxP間的序列互換。

圖2 Cre-LoxP誘導(dǎo)基因重組的方式

二、Cre-LoxP條件性重組

經(jīng)過現(xiàn)代基因工程方法對Cre和LoxP元件的改造，Cre-LoxP系統(tǒng)實現(xiàn)了更加豐富的條件性重組策略。

1、Cre元件改造

在Cre元件的C端接上一段改造過的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD將定位在胞漿內(nèi)，當(dāng)人工合成的激素分子結(jié)合到Cre-LBD受體后，蛋白構(gòu)象改變并進(jìn)入核內(nèi)，介導(dǎo)基因重組，目前使用最多的是Tamoxifen誘導(dǎo)的CreERT2突變體，它的LBD來自于雌激素受體ER分子，當(dāng)有Tmoxifen的時候，Cre才能介導(dǎo)基因重組，這樣通過控制Tamoxifen的注射時間，可以實現(xiàn)對基因重組時間特異性的調(diào)控。

圖3?Tamoxifen誘導(dǎo)的Cre-ER系統(tǒng)

2、Loxp元件的改造

LoxP元件也有一些突變體，間隔區(qū)和回文序列都可以進(jìn)行突變，突變后的序列依然能被Cre重組酶識別和重組，但是突變的LoxP序列必須和同樣突變的LoxP序列匹配介導(dǎo)基因重組，而不能和未突變的LoxP序列匹配，這樣將不同的LoxP序列組合用于控制多個基因（DIO/DO系統(tǒng)中的Lox2272位點），在同一Cre重組酶的作用下，可以實現(xiàn)多序列的基因重組，產(chǎn)生非常多元的重組結(jié)果。

DIO/DO序列

通過引入兩對不同的LoxP位點—LoxP和Lox2272，經(jīng)過兩組Lox位點的兩輪重組可達(dá)到一種穩(wěn)定狀態(tài)。也就是可以通過Cre重組酶的存在與否來控制基因的表達(dá)。

在這種策略下，任一對 Lox 位點間的序列會在 Cre 的作用下發(fā)生可逆的快速翻轉(zhuǎn)，之后 Cre 重組酶馬上不可逆地切割翻轉(zhuǎn)后的同向 Lox 位點，只留下翻轉(zhuǎn)后的基因和單獨的 LoxP、Lox2272 位點，防止基因的再次翻轉(zhuǎn)?；谏鲜鲈恚梢栽诓《据d體中構(gòu)建 DIO 和反向基因，感染 Cre 陽性細(xì)胞后，可以讓Cre陽性的細(xì)胞表達(dá)基因，稱為DIO（Cre-on） 結(jié)構(gòu)；如果預(yù)先包裝的基因是正向，那么 Cre 陽性的細(xì)胞則不表達(dá)基因，其余細(xì)胞表達(dá)基因，稱為DO（Cre-off）結(jié)構(gòu)。

圖4 借助LoxP和Lox2272的DIO/DO策略實現(xiàn)Cre依賴的基因表達(dá)

三、其他重組酶系統(tǒng)介紹

重組酶系統(tǒng)除了經(jīng)典的Cre-Loxp系統(tǒng)外，還有與Cre-Loxp系統(tǒng)無交叉影響的vCre-vLoxP、sCre-sLoxP 系統(tǒng)、Flp/Flpo-FRT系統(tǒng)、Dre-Rox 系統(tǒng)和Vika-vox系統(tǒng)。

1、vCre/sCre系統(tǒng)

vCre/sCre均為Cre重組酶的同源蛋白，但與Cre的同源性很低，可以特異性識別vLoxp/sLoxp位點。

2、Flp-FRT系統(tǒng)

Flp（Flippase recombination enzyme）重組酶，從酵母細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其基因全長1272bp，為48kDa大小的、由423個氨基酸組成的多肽單體蛋白。FRT是Flp的識別位點，全長48bp，包含3個13 bp的重組酶結(jié)合區(qū)和1個8 bp的含Xba I位點的非對稱間隔區(qū)（spacer）。Flp-FRT 系統(tǒng)與 Cre-LoxP 誘導(dǎo)基因重組的方式類似，兩系統(tǒng)明顯的區(qū)別是重組酶（Cre 和 Flp）具有不同的最佳反應(yīng)溫度，有研究發(fā)現(xiàn)，Cre 重組酶的最佳溫度為 37℃，而 Flp 重組酶為 30℃。研究人員后續(xù)構(gòu)建了Flpo—Flp突變體，在37℃也可以表現(xiàn)出較好的耐熱性。

圖5 ?CreFlpDre 系統(tǒng)比較

3、Dre-Rox系統(tǒng)

Dre重組酶來源于D6噬菌體，能特異性地識別一段長度為32bp的DNA序列（Rox位點）并介導(dǎo)該序列間的DNA發(fā)生重組。因其重組效率高且不會與Cre重組酶發(fā)生交叉反應(yīng)，二者常聯(lián)合使用以實現(xiàn)更加精細(xì)的基因操作。

4、Vika-vox系統(tǒng)

Vika重組酶來源于珊瑚弧菌，基因全長1086bp，能特異性地識別一段長度為34bp的DNA序列（vox位點）并介導(dǎo)該序列間的DNA發(fā)生重組。該系統(tǒng)與Cre/Loxp和Flp/FRT系統(tǒng)相比，具有細(xì)胞毒性低，使用范圍廣和安全性高等優(yōu)勢。

圖6?Vika 及 Cre結(jié)構(gòu)模型

四、漢恒重組酶病毒現(xiàn)貨列表

五、Cre-Loxp系統(tǒng)的應(yīng)用案例

1、依賴Cre的條件性基因表達(dá)

文章利用AAV血清型和特異性啟動子結(jié)合Cre-Loxp系統(tǒng)在Cre小鼠特定組織實現(xiàn)目的基因的表達(dá)；如：將AAV5-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry通過腦立體定位注射到Vglut3-Cre小鼠腦DRN區(qū)，結(jié)合化學(xué)遺傳實現(xiàn)DRN區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的激活。

圖7?依賴Cre介導(dǎo)的基因條件性表達(dá)

2、依賴Cre的條件性基因敲除

文章利用AD介導(dǎo)的Cre-Loxp系統(tǒng)可以對特定組織實現(xiàn)目的基因的快速敲除。如：利用AD載體攜帶Cre酶基因，注射到PINCH-1flfl和KrasLSL-G12D/+(Krasflfl/+)工具鼠注入肺誘導(dǎo)KrasG12D的表達(dá)和PINCH-1基因的失活。PINCH-1敲除顯著降低了細(xì)胞增殖，KrasLSL-G12D/+小鼠表達(dá)KrasG12D顯著誘導(dǎo)肺腫瘤形成。

圖8?依賴Cre介導(dǎo)的特定組織基因敲除

3、依賴cre的條件性基因敲低

文章利用AAV-shRNA通過腦立體定位注射Crh-IRES-Cre小鼠PVN區(qū)，在PVN區(qū)實現(xiàn)PSD-93基因的敲低。

圖9?依賴Cre介導(dǎo)的特定組織基因敲低

六、Cre-LoxP系統(tǒng)的優(yōu)點

Cre-LoxP系統(tǒng)是目前在神經(jīng)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的條件性基因敲除工具，主要是因為該系統(tǒng)有如下優(yōu)點：

1、高效性：Cre重組酶與具有LoxP位點的DNA片段形成復(fù)合物之后，可以提供足夠的能力引發(fā)之后的DNA重組過程，重組過程簡約高效；

2、特異性強(qiáng)：LoxP位點是一段含回文序列結(jié)構(gòu)和中間有間隔的34bp元件，這種結(jié)構(gòu)保證了LoxP序列的唯一性，從而保證基因重組的特異性很強(qiáng)；

3、應(yīng)用范圍廣：Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發(fā)揮作用；

4、II型啟動子啟動表達(dá)：Cre重組酶的編碼基因可由任何一種II型啟動子驅(qū)動，由此保證Cre重組酶在生物體不同的細(xì)胞、組織、器官或者在不同的發(fā)育階段或不同的勝利條件下表達(dá)，從而實現(xiàn)較高的組織和細(xì)胞特異性。

至此，本期內(nèi)容就結(jié)束了，主要介紹了“Cre/Loxp及其相關(guān)重組酶系統(tǒng)”，下期我們將分享心血管系統(tǒng)特異性表達(dá)調(diào)控，敬請期待。

參考文獻(xiàn)：

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