由細(xì)菌性病原體結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的結(jié)核病(TB)是一個(gè)主要的全球衛(wèi)生問(wèn)題，每年造成150萬(wàn)人死亡。當(dāng)病原體進(jìn)入肺部時(shí)，細(xì)菌和宿主間產(chǎn)生的相互作用會(huì)誘導(dǎo)組織重塑，產(chǎn)生慢性炎癥病變，即肉芽腫。肉芽腫是結(jié)核病的病理標(biāo)志，然而它們的功能和形成機(jī)制仍然知之甚少。

哈佛大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院免疫與傳染病學(xué)系Eric J. Rubin教授團(tuán)隊(duì)，以“Inflammatory signaling in human tuberculosis granulomas is spatially organized”為題在線發(fā)表于Nature Medicine（IF 87.241）。該研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)以空間蛋白質(zhì)組學(xué)、空間代謝組學(xué)為核心的空間多組學(xué)技術(shù)，揭示了在肉芽腫形成過(guò)程中，其炎癥信號(hào)的空間定位信息及結(jié)核病疾病發(fā)生機(jī)理，為結(jié)核病臨床研究提供了理論依據(jù)。

?研究材料

人結(jié)核肉芽腫組織、兔結(jié)核肉芽腫組織

?技術(shù)路線

步驟1：建立人類(lèi)肉芽腫中蛋白質(zhì)表達(dá)空間解析圖；

步驟2：篩選不同肉芽腫樣本中的差異蛋白；

步驟3：空間代謝組學(xué)檢測(cè)肉芽腫；

步驟4：探究肉芽腫病灶區(qū)促炎反應(yīng)；

步驟5：探究肉芽腫周?chē)钚越M織的抗炎癥反應(yīng)。

?研究結(jié)果

1. 建立人類(lèi)肉芽腫中蛋白質(zhì)表達(dá)空間解析圖

作者使用來(lái)自多個(gè)個(gè)體的肺樣本以及來(lái)自同一肺不同分化階段的肉芽腫，根據(jù)組織學(xué)將這些病變分為固體肉芽腫、干酪樣肉芽腫和空洞性肉芽腫，并通過(guò)空間蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析。首先使用激光顯微切割技術(shù)（LCM）分別提取出實(shí)性肉芽腫活性組織，干酪樣肉芽腫和空腔肉芽腫的活性組織，以及干酪樣肉芽腫和空腔肉芽腫的壞死組織，然后采用Label free方法對(duì)這5種樣本的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，共鑒定到4406個(gè)蛋白，并以此建立了人類(lèi)肉芽腫中蛋白質(zhì)表達(dá)的空間解析圖。

2. 篩選不同肉芽腫樣本中的差異蛋白

作者通過(guò)分析肉芽腫的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)肉芽腫內(nèi)部的變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于肉芽腫亞型之間的變異。PCA分析及聚類(lèi)結(jié)果表明，無(wú)論肉芽腫切除的病變類(lèi)型如何，其活性區(qū)域都聚集在一起，壞死區(qū)域同樣如此。接著作者對(duì)得到的差異蛋白進(jìn)行GO和 KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)具有顯著差異的功能蛋白主要參與炎癥和抗微生物過(guò)程。值得注意的是，參與產(chǎn)生促炎二十烷類(lèi)的蛋白質(zhì)在壞死區(qū)域中也更豐富。此外，代謝花生四烯酸（AA）的蛋白質(zhì)，包括ALOX5, ALOX5AP和LTA4H，在壞死組織區(qū)域中顯著富集。這些結(jié)果表明AA的產(chǎn)物、結(jié)核感染期間炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)二十烷類(lèi)可能發(fā)揮重要作用。

3. 空間代謝組學(xué)檢測(cè)肉芽腫AA

作者使用免疫組化（IHC）和共聚焦顯微鏡來(lái)定位多個(gè)參與含AA溶血磷脂生產(chǎn)的磷脂酶，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)在整個(gè)肉芽腫中彌漫性表達(dá)。雖然生物合成酶的存在表明它們的最終產(chǎn)物可能會(huì)積累，但酶的豐度和其產(chǎn)物可能并不相關(guān)。因此作者使用空間代謝組學(xué)技術(shù)直接測(cè)量AA的豐度，對(duì)人類(lèi)活性、干酪性和空洞性肉芽腫中的AA和AA前體進(jìn)行了成像，發(fā)現(xiàn)它們的豐度模式與空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定的代謝AA的蛋白質(zhì)表達(dá)一致。結(jié)果表明，正常肺組織中很少檢測(cè)到AA，但整個(gè)肉芽腫中都有AA合成，且在壞死組織邊緣富集。此外，兔活性組織和壞死組織的空間代謝成像顯示了與人類(lèi)肉芽腫相似的AA分布模式。

4. 探究肉芽腫病灶區(qū)促炎反應(yīng)

研究表明AA可以進(jìn)入促炎或抗炎通路。白三烯A4水解酶(LTA4H)是代謝AA的蛋白質(zhì)，作為一種促炎二十烷類(lèi)，其能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，且與TNF-α的產(chǎn)生有關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，LTA4H在壞死組織區(qū)域顯著富集。IHC結(jié)果顯示，空洞肉芽腫病變組織和干酪肉芽腫病變組織邊緣有較多的LTA4H，而在實(shí)性肉芽腫中幾乎沒(méi)有LTA4H。此外，TNF-α在實(shí)體肉芽腫中含量相對(duì)較低，但在干酪性肉芽腫和空洞樣肉芽腫的壞死邊緣含量較高。值得注意的是，IHC的結(jié)果表明TNF-α與LTA4H具有相似的分布，共定位約為85.3%。同樣的結(jié)果在兔子的實(shí)性和干酪性病變樣本中得到了重現(xiàn)。這些結(jié)果說(shuō)明空間LTA4H介導(dǎo)的促炎反應(yīng)與TNF-α的產(chǎn)生有關(guān)。

5. 肉芽腫周?chē)钚越M織的抗炎癥反應(yīng)研究

與壞死肉芽腫的中心相反，在肉芽腫周?chē)l(fā)現(xiàn)的細(xì)胞中含有更多的抗炎蛋白質(zhì)組學(xué)特征，即抗炎調(diào)節(jié)劑和還原劑在肉芽腫周?chē)患?。在二十烷?lèi)通路中，前列腺素合成可緩和結(jié)核病變中的炎癥。負(fù)責(zé)前列腺素合成的酶，即環(huán)氧化酶1和2 (COX1/2)，在實(shí)體肉芽腫中富集，與該肉芽腫整體炎癥較輕的特征一致。

通過(guò)LC-MS靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析前列腺素濃度，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诨钚越M織中表達(dá)更豐富。在空洞性肉芽腫和干酪樣肉芽腫中，作者發(fā)現(xiàn)COX1和COX2在活性組織層中廣泛表達(dá)，但在壞死的干酪性區(qū)域中基本不表達(dá)，這與LTA4H豐度的模式形成對(duì)比。此外，雖然LTA4H在巨噬細(xì)胞亞群中特異性表達(dá)，但作者發(fā)現(xiàn)COX1/2在巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)。在兔組織中，相比于TNF-α和LTA4H，COX1/2在活性組織區(qū)域更豐富，而在壞死的干酪性區(qū)域中較少，這與在人類(lèi)組織中的觀察結(jié)果相同。因此，各種二十烷類(lèi)化合物(白三烯)的相對(duì)豐度表明，肉芽腫的高度促炎中心被緩和炎癥的分子包圍，包括COX1/2通路的一些前列腺素，可以緩解炎癥。

?小結(jié)

該文章通過(guò)空間蛋白質(zhì)組學(xué)、空間代謝組學(xué)等研究方法，繪制了人類(lèi)肉芽腫的空間分子圖譜。研究結(jié)果表明，肉芽腫中心具有以抗微生物、ROS和二十烷類(lèi)特征的促炎環(huán)境。相反，肉芽腫周?chē)幕钚越M織具有相對(duì)抗炎的特征，且肉芽腫內(nèi)不同種類(lèi)的區(qū)域之間有獨(dú)特的分子特征。盡管此結(jié)果需要在更大的樣本集中得到證實(shí)，但本文的研究數(shù)據(jù)表明，真正的平衡發(fā)生在局部，系統(tǒng)性干預(yù)可能相當(dāng)復(fù)雜。

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