我國大豆的產(chǎn)量遠遠不能滿足國內需求，提高大豆的耐逆性可以充分利用邊際土地增加大豆種植面積從而提高大豆產(chǎn)量。百趣代謝組學分享，熱激轉錄因子基因在植物生長過程中發(fā)揮了重要作用，然而在大豆耐鹽反應中熱激轉錄因子的功能及機理仍不清楚。

本期文獻：

A class B heat shock factor selected for during soybean domestication contributes to salt tolerance by promoting flavonoid biosynthesis. IF=7.430

百趣代謝組學分享，文獻作者從103份野生大豆資源中篩選得到2份耐鹽性強的野生大豆資源，通過RNA-Seq差異表達基因和共表達網(wǎng)絡分析得到參與大豆鹽脅迫反應的B類轉錄因子基因HSFB2b。在大豆轉基因毛狀根體系和穩(wěn)定的轉基因大豆中過表達HSFB2b均可以提高大豆的耐鹽性。進一步研究發(fā)現(xiàn)HSFB2b可以直接激活黃酮類化合物合成途徑，同時解除另一個轉錄因子GmNAC2的抑制作用，從而促進黃酮類化合物的合成，降低體內ROS的積累以提高大豆的耐鹽性。

圖：HSFB2b的工作模型

圖1鹽脅迫下野生大豆hub轉錄因子基因的鑒定及HSFB2b在轉基因大豆毛狀根耐鹽性中的作用。

用1.5%NaCl篩選103份野生大豆材料，鑒定出2份耐鹽野生大豆y20和y55，發(fā)芽率高。百趣代謝組學分享，再用1%NaCl處理后，三種材料的生長都受到抑制（圖1a）。然而，兩個耐鹽品種y20和y55在處理后的存活率顯著高于鹽敏感品種y0532（圖1b）。Y20和Y55中反映細胞膜損傷的相對電解質滲漏也顯著低于Y0532（圖1C）。百趣代謝組學分享，這些結果表明y20和y55比y0532更耐鹽。為了確定這些野生大豆對鹽脅迫差異反應的潛在基因，將3周齡的幼苗置于150 mM NaCl處理0、3、6和12 h，然后收集根進行轉錄組測序。與相應的“0”點相比至少在一個時間點顯示2倍差異（fdr<0.05）的基因被視為總差異表達基因（degs）。

在這些差異表達的基因中，選擇在兩種耐鹽材料（y20和y55）中表達量均高于鹽敏感材料y0532的轉錄因子基因作為誘餌，對總差異表達基因進行共表達網(wǎng)絡分析（圖1d）。百趣代謝組學分享，利用轉基因大豆毛狀根系統(tǒng)檢測上調的hub轉錄因子基因（圖1d）在鹽脅迫耐受中的功能。在這些被檢測的基因中，只有編碼b型熱休克因子（hsf）的glyma.11g025700表現(xiàn)出一致的耐鹽表型。來自glyma.11g025700位點的編碼蛋白與擬南芥HSFB2b（圖1e）聚簇，因此命名為HSFB2b以供進一步研究。

研究了鹽脅迫對大豆HSFB2b表達的影響。在葉和根中均高度誘導，耐鹽Y55和Y20的誘導水平高于鹽敏感Y0532、HSFB2b在根和其他大豆器官中表達輕微，但在種子發(fā)育的中期，在h5種子中高表達（圖1f-h）。百趣代謝組學分享，并且HSFB2b在轉基因毛狀根中的過表達可以提高大豆的耐鹽性（圖1i-l）。

圖2鹽脅迫下野生大豆hub轉錄因子基因的鑒定及HSFB2b在轉基因大豆毛狀根耐鹽性中的作用。

作者用雙熒光素酶報告法測定了擬南芥原生質體中HSFB2b的轉錄調控活性。顯示HSFB2b具有轉錄抑制活性（圖2a）。百趣代謝組學分享，為鑒定HSFB2b的靶基因，采用35s-HSFB2b-gfp轉基因毛狀根，用抗gfp抗體進行染色質免疫沉淀測序（chip-seq）。以35s-gfp轉基因毛狀根為陰性對照。35s-HSFB2b-gfp毛狀根的芯片信號富集度高2.5倍，表明hsp2b與gmnac2啟動子區(qū)有關（圖2c）。

然后，對HSFB2b轉基因毛狀根中gmnac2的轉錄水平進行了分析。與k599根相比，HSFB2b毛狀根中gmnac2表達下調，而hsfb2b rnai毛狀根中gmnac2表達上調，表明HSFB2b抑制gmnac2表達（圖2d）。通過進一步分析gmnac2啟動子，發(fā)現(xiàn)了三個hsf結合元件（ngaannttcn），其中一個位于芯片qpcr產(chǎn)品中。凝膠移位試驗表明HSF2Bb直接結合到GMNAC2啟動子（圖2E）。煙草中瞬時表達分析顯示HSFB2b抑制了GMNAC2的啟動子活性（圖2F，2G）。

這些結果表明HSFB2b通過直接與啟動子結合抑制gmnac2的表達。由于HSFB2b的過表達增強了毛狀根的耐鹽性，HSFB2b直接調節(jié)gmnac2的表達，作者用上調或下調的gmnac2。經(jīng)過nacl處理后，轉基因毛狀根的生長速度比轉k599或gmnac2 rnai基因的根慢，伸長?。▓D2I，2J）。與對照相比，含gmnac2-oe根的大豆植株葉片表現(xiàn)出明顯的黃化現(xiàn)象。百趣代謝組學分享，結果表明，gmnac2對大豆毛狀根的耐鹽性具有負調控作用。

同時高表達HSFB2b和gmnac2的轉基因毛狀根，轉基因毛狀根在鹽脅迫下表現(xiàn)出與gmnac2 oe轉基因毛狀根相似的表型，而hsfb2boe轉基因毛狀根在鹽脅迫下表現(xiàn)良好（圖2l）。HSFB2b-和gmnac2過表達轉基因毛狀根的大豆植株葉片表現(xiàn)出明顯的葉片失綠，這與gmnac2-oe根植株的葉片失綠相似（圖2m）。相對電解質泄漏水平也顯示出一致的變化（圖2n）。這些結果表明，gmnac2基因在鹽脅迫調控中起著HSFB2b下游的作用。

圖3HSFB2b轉基因大豆黃酮合成相關基因表達上調。

對轉基因處理的OE-26組和JACK組的degs進行基因本體（GO）和KEGG通路分析。GO分析表明，參與刺激反應和苯丙酸代謝的基因高度富集。百趣代謝組學分享，KEGG數(shù)據(jù)顯示，參與類黃酮生物合成的基因在葉和根中都很豐富（圖3a）。這表明HSFB2b可能通過影響苯丙酸和類黃酮的生物合成來調節(jié)鹽脅迫。

然后作者檢測了在HSFB2b過度表達的大豆植株中類黃酮生物合成相關基因的表達。百趣代謝組學分享，在HSFB2b轉基因大豆中，類黃酮生物合成的其他調節(jié)因子（r2r3myb/bhlh同源基因）被上調，HSFB2B在煙葉分析中激活了GMC4H和GMCHS3的啟動子活性（圖3d，3f）。因此，HSFB2b可能直接激活黃酮生物合成中gmc4h和gmchs3的表達。

采用液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）法進一步測定了膨大葉片、根系和種子中黃酮類化合物的含量。使用40 mg粉末樣品，采用高效液相色譜-質譜法測定黃酮類化合物。采用安捷倫1290無限長液相色譜儀和6550電噴霧四極飛行時間串聯(lián)質譜儀組成的uhplc-ms/ms系統(tǒng)對提取物進行分析。

分析了葉片中的23種黃酮成分和根和種子中的20種成分。HSFB2b轉基因大豆的葉、根和種子中總黃酮含量顯著增加（圖3h）。綜上所述，HSFB2b高表達大豆促進了黃酮類化合物的生物合成。百趣代謝組學分享，黃酮類化合物可能參與了HSFB2b轉基因大豆的耐鹽性。為了研究黃酮類化合物在鹽脅迫下的作用，作者將黃酮類化合物合成的中間產(chǎn)物槲皮素應用于大豆幼苗。鹽脅迫處理后，對照植株出現(xiàn)葉片失綠，而槲皮素處理的植株表現(xiàn)出比模擬植株更好的表現(xiàn)（圖3i，3j）。

圖4gmnac2抑制gmchs1、gmchs4、gmfls1和gmfls2的表達。

作者檢測了在HSFB2b過度表達的大豆植株中gmnac2的轉錄水平。在HSFB2b過度表達的幼苗中，gmnac2的表達顯著下調（圖4a）。為了了解gmnac2與類黃酮生物合成的關系，對轉基因毛狀根中類黃酮生物合成相關基因的表達進行了檢測。百趣代謝組學分享，作者發(fā)現(xiàn)在高表達gmnac2的毛狀根中類黃酮生物合成相關基因的表達減少（圖4b）。同時，芯片qpcr分析顯示gmnac2最有可能與gmchs1、gmchs4、gmfls1和gmfls2的啟動子結合，因為芯片信號在35s-gmnac2-gfp轉基因毛狀根中比在35s-gfp根中豐富（圖4c）。此外，GMNAC2在煙葉分析中抑制了這些基因的啟動子活性（圖4d，4e）。這些結果表明HSFB2b抑制gmnac2的表達，釋放類黃酮生物合成，具有抗鹽脅迫作用。

圖5大豆馴化過程中選擇的與耐鹽性相關的HSFB2b啟動子單倍型。

在HSFB2b啟動子區(qū)鑒定出4個單倍型，并且從野生大豆添加y20中挑選出的單倍型ii顯然是在馴化過程中用于栽培大豆的耐鹽性和/或種子性狀（圖5）。百趣代謝組學分享，使用KF（具有單倍型IV）和NN（具有單倍型II）之間的交叉衍生的RIL群體進行關聯(lián)分析進一步支持具有單倍型II啟動子的HSFB2b與耐鹽性相關的建議（圖5g）。

單倍型ii啟動子的變異可能為鹽脅迫下HSFB2b基因的誘導提供了新的蛋白質組合和連接，從而使大豆具有更好的適應性生長。值得一提的是，單體型Ⅱ型HSFB2b啟動子在中國東北地區(qū)到黃淮海地區(qū)的栽培大豆品種中廣泛存在，這可能是由于選擇的緣故，盡管黃淮海地區(qū)的一些省份的大豆品種可能仍然存在。通過引入單倍型進行改進ii HSFB2b啟動子。

值得注意的是，野生大豆y55的iii型HSFB2b啟動子在鹽脅迫下具有最高的啟動子活性，可能具有更好的耐鹽性，但在栽培大豆中的分布頻率仍然很低。百趣代謝組學分享，這種罕見的iii型HSFB2b啟動子可作為馴化過程中下一波選擇的靶點。通過育種將這種罕見的單倍型引入大豆品種，可以進一步提高大豆在鹽脅迫下的表現(xiàn)，從而在不利條件下獲得較好的產(chǎn)量。

結論

總之，作者從野生大豆中鑒定出一種b型熱休克因子HSFB2b，該蛋白通過直接和/或間接促進類黃酮生物合成而賦予大豆耐鹽能力。在馴化過程中選擇了HSFB2b基因的Ⅱ型啟動子，鹽脅迫下活性最高的稀有Ⅲ型HSFB2b啟動子可能是下一輪大豆育種選擇的目標。