基因敲除H9C2細(xì)胞系

胚胎大鼠心肌細(xì)胞的H9C2系是Kimes和Brandt（1976）從胚胎BD1X大鼠心臟組織衍生而來的原始克隆細(xì)胞系的亞克隆系。該細(xì)胞系顯示出骨骼肌的許多特性，其參數(shù)在抗癌藥的臨床前測試，確定其心臟毒性，安全性以及進(jìn)入后續(xù)臨床測試階段的可能性時特別有用。因此，H9C2細(xì)胞系廣泛用于許多體外研究中，其中一些涉及CRISPR技術(shù)來介導(dǎo)H9C2細(xì)胞的特性。

H9C2細(xì)胞保留了一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成部分，這些成分對于它們分化為成熟的心肌細(xì)胞至關(guān)重要。該細(xì)胞系特別用于新的主要是抗癌藥物（例如阿霉素）的心臟毒性分析，心肌細(xì)胞損傷機理的研究以及所研究化合物對心肌細(xì)胞凋亡和壞死的毒性作用的評估。胚胎H9C2心肌細(xì)胞在體外條件下增殖良好，可以相對輕松地培養(yǎng)，適合用作CRISPR基因敲除/敲除或過表達(dá)模型，用于心臟肥大的體外研究，并支持目前與人類心肌細(xì)胞系一起用于前瞻性分子研究的工作心臟發(fā)育和疾病。

應(yīng)用范圍：

1. C3G基因敲除對H9C2心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

先前的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠梗塞周圍非梗塞區(qū)域的心肌中，C3G表達(dá)顯著增加。過表達(dá)的C3G可促進(jìn)心肌細(xì)胞存活并抑制細(xì)胞毒性，而降低C3G則可抑制心肌細(xì)胞存活并增加心肌細(xì)胞凋亡。使用CRISPR / Cas9系統(tǒng)內(nèi)置的敲除C3G重組慢病毒感染H9C2心肌細(xì)胞，以研究C3G敲除對H9C2心肌細(xì)胞增殖的推測作用和機制。用上述慢病毒分別感染H9C2心肌細(xì)胞，以研究C3G（Crk SH3域結(jié)合鳥嘌呤核苷酸交換因子）敲除對H9C2心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其潛在機制。

2.利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除H9c2細(xì)胞的Tudor-SN基因，抑制細(xì)胞周期阻滯和增殖

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)被用于敲除大鼠心肌H9c2細(xì)胞的Tudor-SN（Tudor葡萄球菌核酸酶）基因。研究人員觀察到它對H9c2細(xì)胞周期和增殖的影響。選擇PX462質(zhì)粒作為載體，使用軟件設(shè)計可以特異性識別H9c2細(xì)胞中Tudor-SN基因第二外顯子的上，下游sgRNA（單導(dǎo)RNA）。隨后，將這對質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化為H9c2細(xì)胞，然后選擇陽性單克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。用蛋白質(zhì)印跡法鑒定敲除作用，并使用成功敲除的細(xì)胞系通過流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8 =實驗檢測細(xì)胞周期和增殖。 Western印跡結(jié)果表明，Tudor-SN蛋白在陽性細(xì)胞中不表達(dá)，并成功敲除了Tudor-SN基因。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，Tudor-SN基因敲除細(xì)胞具有G1期阻滯。 CCK-8實驗的結(jié)果表明KO細(xì)胞的增殖速率減慢。本實驗成功構(gòu)建了H9c2細(xì)胞的Tudor-SN基因敲除細(xì)胞系，并檢測了Tudor-SN基因敲除對細(xì)胞周期阻滯和增殖的抑制作用，為Tudor-SN基因在H9c2細(xì)胞的調(diào)控提供了研究。心肌細(xì)胞功能。便利的工具和研究基礎(chǔ)。

3. Dock180基因敲除抑制大鼠源性H9C2心肌細(xì)胞株的增殖并促進(jìn)其凋亡

為了研究胞質(zhì)分裂抑制劑1（Dock180）敲除對大鼠源H9C2心肌細(xì)胞增殖和凋亡及其機制的影響，使用CRISPR / Cas9系統(tǒng)設(shè)計和構(gòu)建了靶向大鼠Dock180基因的單個向?qū)NA（sgRNA）。將包含在sgRNA上方的質(zhì)粒包裝到慢病毒中，并選擇其敲除心肌細(xì)胞中的Dock180。結(jié)果表明，用CRISPR / Cas9 H9C2細(xì)胞敲除Dock180可以抑制增殖，并通過p-ERK1 / 2，Bcl-2和Bax促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞凋亡。

Ubigene Biosciences，我們提供高效和100％保證的CRISPR服務(wù)，包括基因敲除/敲入和點突變細(xì)胞系。使基因組編輯更加容易是Ubigene的目標(biāo)。我們的專有技術(shù)已成功應(yīng)用于100多種類型的細(xì)胞系中。

CRISPR-U?是Ubigene Bioscience獨立開發(fā)的專有技術(shù)，用于基因編輯細(xì)胞系。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對GLUL基因組位點進(jìn)行靶向測序，產(chǎn)生產(chǎn)生產(chǎn)生EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機制

源井生物根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計。

?方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

Reference:

?Fan L, Kadura I, Krebs LE, Hatfield CC, Shaw MM, Frye CC, Improving the efficiency of CHO cell line generation using glutamine synthetase gene knockout cells.

Aga, M., Yamano, N., Kumamoto, T. et al. Construction of a gene knockout CHO cell line using a simple gene targeting method. BMC Proc 9, P2 (2015).

Noh, S.M., Shin, S. & Lee, G.M. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep 8, 5361 (2018).

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