如何從FFPE樣本中獲得高質(zhì)量核酸
什么是FFPE樣本
FFPE（Formalin-fixed paraffin-embedding）即用福爾馬林將組織或細胞固定后用石蠟包埋，是一種組織或細胞保存技術(shù)。福爾馬林中的甲醛可以與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，使蛋白質(zhì)凝固變性，保持組織細胞結(jié)構(gòu)的完整性?[1]。通過FFPE技術(shù)處理得到的樣本我們稱為FFPE樣本，因?qū)嶋H使用時會切成薄片，也稱石蠟切片。
FFPE樣本的應(yīng)用
這項技術(shù)長期以來在臨床檢驗、醫(yī)學科學研究中得到廣泛應(yīng)用，尤其是細胞形態(tài)學研究和腫瘤病理學研究，如：HE染色、免疫組化及熒光原位雜交等。隨著分子生物學的發(fā)展，F(xiàn)FPE樣本在分子診斷及研究的應(yīng)用需求越來越多。目前在NGS醫(yī)檢所中，除去血液樣本，接收的所有組織樣本幾乎均為蠟塊、白片、蠟卷等FFPE樣本。為了保證NGS實驗數(shù)據(jù)的準確性與真實性，從FFPE樣本中純化出高質(zhì)量的核酸十分重要。
影響FFPE樣本中核酸質(zhì)量的因素
一般核酸提取純化有三個質(zhì)檢指標：核酸濃度、核酸純度及核酸完整度，而FFPE樣本由于福爾馬林處理，損傷核酸，影響下游應(yīng)用數(shù)據(jù)的真實性，提高了核酸提取難度。
一般來說FFPE 樣本可以保存長達數(shù)年時間，但超過一年的FFPE樣本不建議用于NGS實驗。即使在一年內(nèi)，隨著保存時間的增加，DNA的片段化也會加劇，因此應(yīng)用于NGS檢測的FFPE樣本應(yīng)該在采樣后盡快完成實驗。
FFPE樣本制備及核酸純化處理
要想從FFPE樣本中提取純化出高質(zhì)量的核酸，首先需要得到高質(zhì)量的FFPE樣本，從FFPE樣本的制備到核酸的提取，我們需要注意以下幾點。
FFPE樣本的制備
01.樣本的選擇
FFPE可以采用新鮮組織樣本或細胞樣本進行制備。對于腫瘤病理組織樣本而言，目的是研究腫瘤細胞，因此在活檢或手術(shù)取組織樣本時腫瘤組織的占比一般要大于20%以上[2]，并在取樣后要用生理鹽水沖洗，避免血液中g(shù)DNA污染。周圍炎癥嚴重的腫瘤細胞、黏液產(chǎn)生過多的腫瘤細胞、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細胞不能采集，以免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。手術(shù)采樣的腫塊組織不低于50mg，穿刺采樣應(yīng)≥2條，長度≥0.5 cm[3]。
02.福爾馬林固定
a.組織新鮮。務(wù)必在組織離體后30min內(nèi)浸入適量組織固定液中進行固定。
b.適當?shù)墓潭ㄒ骸?/strong>液體與組織大小比例為10:1，應(yīng)當使用中性的福爾馬林緩沖溶液，避免使用酸性及含有重金屬離子的固定液，目前市面上有使用多聚甲醛代替。
c.適當?shù)墓潭〞r間。時間較短可能導致標本較深處組織未滲入福爾馬林，而發(fā)生核酸和蛋白降解。固定時間過長則導致更密集的交聯(lián)，讓核酸和蛋白的提取變得更加困難。體積較大的標本應(yīng)充分固定至6-48h，但不超過72h，小活檢標本固定6-12h即可[4]。
新鮮組織放入RNA保護液作為對照組，福爾馬林分別固定20h和72h并進行石蠟包埋作為實驗組，利用Agilent? 2100 Bioanalyzer分析。并使用一步法RT-PCR驗證。擴增子大小如圖所示，RT-PCR的結(jié)果以顏色顯示：紅色表示無擴增，黃色表示弱的擴增，綠色表示成功的擴增。盡管較長時間的固定對RNA片段化和核糖體條帶影響甚微，但較長擴增子的擴增效率差。推測由于RNA分子的過度交聯(lián)和較高比例的不可逆交聯(lián)導致。
d.合適的組織大小。福爾馬林大約以1 mm/小時的速率滲透組織，通常建議固定最多5 mm厚的組織標本。
將大鼠的腎與腦組織整個器官（whole）與≤4 mm的器官切片（cut）分別進行福爾馬林固定和石蠟包埋。左圖包埋后3天純化RNA，并利用Agilent? 2100 Bioanalyzer分析。在整個腦組織（whole Brain）的電泳峰圖中，雙箭頭指出了18S rRNA和28S rRNA的峰減少，表明RNA片段化的增加。右圖純化的RNA被用于一步法RT-PCR中，從左到右，擴增子大小分別為96nt、206nt、400nt、613nt和785nt。從圖可以看出較大片段的RNA存在降解。
FFPE樣本的核酸純化
01.脫蠟（脫蠟要徹底）
因為FFPE樣本的特殊性，石蠟會阻礙消化液對組織的滲透，抑制蛋白酶K對組織內(nèi)蛋白質(zhì)的消化，從而影響核酸的釋放。為消除石蠟對DNA提取和PCR擴增的不良影響，對組織進行徹底的脫蠟十分重要。傳統(tǒng)的脫蠟方式為二甲苯脫蠟，二甲苯脫蠟不僅容易造成核酸片段化和得率低，而且對人有毒害，切片越厚或存放時間越長，脫蠟效果越差。目前市面上主流方案是采用無毒脫蠟液，以及Covaris的超聲乳化脫蠟。
02.組織消化
為了將DNA與結(jié)合的蛋白質(zhì)分離，F(xiàn)FPE樣本需經(jīng)受高溫和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白質(zhì)組分以及樣品中可能存在的任何核酸酶，這個步驟還可防止DNA發(fā)生降解。對消化時間進行優(yōu)化十分重要。消化的時間過短，DNA的釋放不充分，導致核酸提取的得率低。消化時間可以根據(jù)組織類型、組織大小進行調(diào)節(jié)，使DNA充分釋放。
03.解交聯(lián)
由于FFPE樣品包含的DNA分子會彼此交聯(lián)，并與RNA和蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，故這些交聯(lián)必須斷裂，才能釋放出DNA用于后續(xù)純化。建議在80℃的環(huán)境下，孵育樣品一個小時，以達到逆轉(zhuǎn)交聯(lián)的目的。
福爾馬林固定導致核酸之間、蛋白之間以及核酸和蛋白之間的交聯(lián)。固定時間越長，交聯(lián)程度越大，純化難度越大。
04.核酸的提取
核酸的提取有多種成熟的方法，包括酚氯仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等，各方法在提取FFPE樣本核酸時沒有太大差異，只需要根據(jù)自己的實驗需要選擇即可。
05.質(zhì)控
對提取出來的核酸進行質(zhì)控十分重要，對于FFPE樣本中提取的核酸，通過吸光度檢測樣品純度（Nanodrop），熒光定量（Qubit）及毛細管電泳儀進行測定核酸濃度、OD值（純度）及片段大?。―IN），除此之外還可參考Alu247/Alu115和Q Score。
Alu247/Alu115：Alu序列是廣泛分布于人基因組的約300bp短重復(fù)序列。通過長（247 bp; Alu247）、短（115 bp; Alu115）擴增子比值可評估gDNA的完整度。
Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR擴增產(chǎn)物濃度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分別指129bp和41bp產(chǎn)物、305bp和41bp產(chǎn)物濃度比值。
FFPE樣本的在NGS中應(yīng)用
上面有提到由于福爾馬林的固定導致FFPE樣本提取核酸存在的問題，如DNA斷裂、胞嘧啶（C）脫氨基、無堿基位點的產(chǎn)生等，均可能導致得到錯誤的核酸信息，特別是脫氨基導致的C:G > T:A人為突變。而這些不真實的DNA信息導致形成FFPE DNA序列偽影（sequence artifacts）。序列偽影是由固定、包埋等過程人為引入的序列突變[6]，具體表現(xiàn)為NGS結(jié)果中DNA序列出現(xiàn)了一些在固定之前不存在的堿基變化，這些人為突變使NGS檢測出現(xiàn)假陰性和假陽性的問題。Lamy和他的同事研究發(fā)現(xiàn)，在993例福爾馬林固定的結(jié)直腸癌中，有53例（5%）存在KRAS基因密碼子12和13人工變異(14例)。
雖然FFPE在NGS檢測中存在偽影的問題，但FFPE樣本的易保存性以及臨床中與病理緊密關(guān)系使這種類型樣本的應(yīng)用仍有很大優(yōu)勢，那如何提高FFPE樣本在NGS檢測中的準確度呢？在降低FFPE樣本中DNA的損傷方法中總結(jié)如下圖：
總結(jié)
如何從FFPE樣本中提取出高質(zhì)量的核酸，下圖對本文重點進行總結(jié)：
參考文獻
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