陰離子交換層析去除乙腦疫苗制品中殘留DNA

陰離子交換層析去除乙腦疫苗制品中殘留DNA，其特點(diǎn)是將乙腦疫苗濃縮液凝膠過濾層析所獲得的初步純化液進(jìn)行陰離子交換層析，使DNA牢固吸附在色可賽思離子交換介質(zhì)上而乙腦病毒蛋白直接穿透，從而達(dá)到去除宿主DNA。解決目前乙腦疫苗行業(yè)面臨的質(zhì)量問題。

凝膠層析與離子交換層析結(jié)合法純化地鼠腎細(xì)胞狂犬病疫苗

2010版《中國藥典》中人用狂犬病疫苗中的蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)提高,要求純化后未加穩(wěn)定劑的病毒液中總蛋白含量不高于80μg/劑,牛血清蛋白殘留應(yīng)不高于50ng/劑,成品中宿主細(xì)胞蛋白殘留不高于24μg/劑,提高純化分離效果則是生物藥企要攻克的2010版藥典的要求,可以作為建立純化工藝的參考,也可作為各相關(guān)技術(shù)人員操作及實(shí)驗(yàn)參考.層析系統(tǒng)在疫苗純化中的應(yīng)用研究一直是個(gè)備受關(guān)注課題,上樣體積,上樣速度,上樣濃度和抗原收集起止點(diǎn)的選擇,都是影響疫苗純化效果的因素,而凝膠層析柱與色可賽思離子交換層析柱的組合方式更好地發(fā)揮了兩種層析柱的特點(diǎn),優(yōu)化了疫苗的純化效果,生物藥企可根據(jù)生產(chǎn)情況,合理靈活使用兩種層析柱,保證疫苗質(zhì)量,提高純化效率。

離子交換法去除流腦多糖疫苗粗糖中的雜蛋白

b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗簡(jiǎn)稱Hib結(jié)合疫苗,人體特別是2歲以下幼兒接種該疫苗后可以產(chǎn)生針對(duì)b型流感嗜血桿菌的特異性抗體而得到保護(hù).b型流感嗜血桿菌莢膜抗原的組成是多聚核糖基核糖醇磷酸鹽(PRP),Hib多糖蛋白結(jié)合疫苗中殘余溴化氰檢測(cè)方法.該方法基于高效陰離子交換色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測(cè)器,樣品檢測(cè)速度快,單個(gè)樣品上樣分析只需10分鐘.并對(duì)該方法進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證.驗(yàn)證結(jié)果表明該方法專屬性好,最小定量限可以達(dá)到5μg/L,檢出范圍在10-1001μg/L時(shí)線性良好,是一個(gè)比較好的檢測(cè)Hib多糖蛋白結(jié)合疫苗中殘余氰化物的方法. 2,研究建立了Hib多糖蛋白結(jié)合疫苗中殘余CDAP檢測(cè)方法.色可賽思陽離子交換色譜串聯(lián)紫外檢測(cè)器,使用該方法對(duì)單個(gè)樣品上樣只需30分鐘就可完成分析.后期對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果表明該方法專屬性好,最小定量限可以達(dá)到16μg/L,檢出范圍在100-1000μg/L時(shí)線性良好,是一個(gè)比較好的檢測(cè)Hib多糖蛋白結(jié)合疫苗中殘余CDAP的方法.

高效陰離子交換色譜-脈沖安培法檢測(cè)A、C、Y和W135群腦膜炎球菌多糖含量

交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)測(cè)定A,C,Y和W135群腦膜炎球菌多糖含量,并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證及初步應(yīng)用.保護(hù)柱;使用氫氧化鈉/醋酸鈉梯度洗脫,以多糖抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并對(duì)建立的方法進(jìn)行專屬性,精密度和準(zhǔn)確性驗(yàn)證;同時(shí)與傳統(tǒng)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析.結(jié)果 A,C,Y和W135群腦膜炎球菌多糖質(zhì)量濃度在0.5～27.0μg/m L范圍內(nèi)與峰面積均具有良好線性關(guān)系,r=0.999.該方法專屬性高,分析結(jié)果重復(fù)性良好,RSD均〈5%;回收率均在95%～105%范圍內(nèi);與傳統(tǒng)的火箭免疫電泳法相比,檢測(cè)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05).結(jié)論 HPAEC-PAD準(zhǔn)確,可靠,重復(fù)性好,可用于檢測(cè)腦膜炎球菌多糖原液及疫苗成品中的多糖含量.

溶液環(huán)境對(duì)百日咳疫苗分離純化

交換層析和凝膠過濾層析進(jìn)行百日咳疫苗的分離純化,通過ELISA抗原活性測(cè)定和還原性SDS-PAGE等方法研究了脲對(duì)百日咳疫苗分離純化的影響,,在流動(dòng)相中加入2 mol/L脲作為穩(wěn)定劑.能顯著提高色可賽思離子交換層析和.

Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒純化的離子交換層析

Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒(Sabin strain polio virus,sPV)純化的離子交換層析(ion exchange chromatography,IEC)條件.方法在不同層析條件下對(duì)sPV凝膠層析粗純液進(jìn)行IEC。

重組幽門螺桿菌過氧化氫酶脂質(zhì)體疫苗免疫

目的探討制備脂質(zhì)體包裹重組幽門螺桿菌過氧化氫酶(Kat)口服疫苗的方法,陰離子交換層析和0凝膠過濾層析分離純化Kat重組蛋白,用薄膜分散法制備以卵磷脂和膽固醇為膜組分包裹的Kat重組蛋白口服疫苗,并用透射電鏡測(cè)定其粒徑.BALB/c小鼠分為5組,分別通過灌胃方法給予PBS、空白脂質(zhì)體、Kat重組蛋白+霍亂毒素(CT)、脂質(zhì)體包裹Kat重組蛋白、脂質(zhì)體包裹Kat重組蛋白和CT,每周1次共4次,末次攻擊2周再用活H·pylori攻擊3次,3周后處死小鼠,行胃組織快速尿素酶試驗(yàn)、H·pylori的定植半定量,取脾組織行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn).結(jié)果以包涵體為主的表達(dá)產(chǎn)物占全菌總蛋白的24.4%,經(jīng)純化獲得純度為95%的重組蛋白,制備的脂質(zhì)體粒徑為0.7±0.4μm.PBS組和空白脂質(zhì)體組保護(hù)率均為0,而Kat重組蛋白+CT組、脂質(zhì)體包裹Kat重組蛋白組、脂質(zhì)體包裹Kat重組蛋白+CT組的保護(hù)率分別為73.3%、66.7%和86.7%,且均能使免疫小鼠胃黏膜H·pylori感染數(shù)目明顯減少,三個(gè)疫苗組淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)均為陽性.結(jié)論口服脂質(zhì)體能部分代替免疫佐劑的作用,將其作為H·pylori疫苗的免疫佐劑。

離子交換層析純化制備人輪狀病毒滅活疫苗

離子交換層析純化制備人輪狀病毒滅活疫苗的方法,涉及病毒制備滅活疫苗的方法.濃縮病毒收獲液,經(jīng)色可賽思離子交換柱層析純化,純化產(chǎn)物透析脫鹽,過濾除菌滅活等得到人輪狀病毒滅活疫苗;進(jìn)一步進(jìn)行純度,總蛋白去除率和感染性滴度檢測(cè),并進(jìn)行抗原性,免疫原性檢測(cè)及基因組帶型穩(wěn)定性檢測(cè).本發(fā)明純化后病毒收獲液總蛋白去除率為99.69%,病毒純化前后感染性滴度分別為4.25lgCCID50/ml和7.0lgCCID50/ml,純化的病毒滅活后病毒基因組帶型未發(fā)生變異,保持了良好的抗原性和免疫原性.

狂犬病疫苗殘余DNA去除

Vero細(xì)胞廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)中.由于疫苗中Vero細(xì)胞DNA殘留可能存在著對(duì)人體致腫瘤性風(fēng)險(xiǎn),且DNA殘留量越高,DNA片斷越大,這種風(fēng)險(xiǎn)性越高.因此,在疫苗生產(chǎn)過程中如何降低疫苗中Vero細(xì)胞的DNA殘留量,保證疫苗質(zhì)量具有重要意義. 目前多數(shù)狂犬病疫苗生產(chǎn)廠家應(yīng)用Vero細(xì)胞作為病毒培養(yǎng)載體繁殖病毒,收獲病毒液后普遍通過超濾濃縮,分子篩層析等純化工藝進(jìn)行純化,制品中DNA殘留去除效果不理想.為此,在病毒濃縮,純化過程中,技術(shù)人員對(duì)病毒液濃縮倍數(shù),分子篩過程中柱效,上樣量,洗脫液中相關(guān)鹽的成分配比及pH,洗脫液流速等條件和相關(guān)參數(shù)進(jìn)行多方面的調(diào)整嘗試,從結(jié)果來看,仍不能從根本上解決疫苗中Vero細(xì)胞DNA殘留超標(biāo)的問題. 從病毒培養(yǎng)階段開始,培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,調(diào)整細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),在提高病毒收獲液滴度的同時(shí),盡量減少細(xì)胞脫落和破碎,降低病毒液中Vero細(xì)胞DNA釋放量;選擇合適孔徑的超濾膜包,在超濾過程中確?？乖粨p失的前提下有效透除部分殘余DNA和牛血清蛋白,減少后期進(jìn)一步去除DNA的純化難度;增加陰離子交換柱工藝,篩選能較好吸附殘余DNA的陰離子交換介質(zhì)的同時(shí),減少抗原損失,以期達(dá)到《中國藥典》第三部規(guī)定的質(zhì)量要求.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,優(yōu)化培養(yǎng)條件,選用300KD超濾膜效果顯著,使用色可賽思陰離子交換柱。

人乳頭狀瘤病毒6型類病毒顆粒的制備及其中和抗體的檢測(cè)

目的利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備人乳頭狀瘤病毒6型(human papillomavims type6,HPV-6)類病毒顆粒(virus-like particles,VfJP)并研究其免疫原性.方法在大腸桿菌ER2566中表達(dá)HPV-6L1蛋白,并以硫酸銨沉淀,離子交換色譜,疏水相互作用色譜等手段對(duì)其進(jìn)行純化.純化后的HPV-6L1經(jīng)體外組裝形成VLP后以動(dòng)態(tài)光散射,透射電鏡對(duì)其形態(tài)進(jìn)行檢測(cè),并以假病毒中和實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)HPV-6L1VLP在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)所誘導(dǎo)的抗HPV-6/11中和抗體水平.結(jié)果HPV-6L1蛋白在大腸桿菌中以可溶形式表達(dá),經(jīng)過純化后的HPV-6L1蛋白可以在體外組裝為半徑25rim左右的VLP.該VLP可以在山羊及兔體內(nèi)誘導(dǎo)高滴度的HPV-6/11中和抗體.結(jié)論大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以簡(jiǎn)便高效制備具有免疫原性的HPV-6VLP,可以用于HPV-6疫苗的研究.