寫在前面

????????今天推薦的是由阿根廷皮拉爾市布宜諾斯艾利斯大學(xué)在2021年3月13日發(fā)表于Oncogenesis（2020IF：7.4847，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是MarioRossi教授，研究表明USP19調(diào)節(jié)癌細(xì)胞遷移和侵襲，并作為早期乳腺癌患者的新型預(yù)后標(biāo)志物。

研究背景

????????癌癥患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散與其存活率和生活質(zhì)量顯著降低有關(guān)。泛素化途徑在正常和應(yīng)激條件下維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，其失調(diào)與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和侵襲能力有關(guān)，因此突出了其作為潛在治療靶點(diǎn)的價(jià)值。

摘要部分

????????為了鑒定腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的新分子靶標(biāo)，作者使用針對(duì)泛素化途徑相關(guān)基因的shRNA文庫(kù)進(jìn)行了遺傳篩選。作者鑒定了去泛素化酶USP19，并證明其沉默降低了高侵襲性乳腺癌細(xì)胞系的遷移和侵襲潛力。作者還進(jìn)行了體內(nèi)研究并證實(shí)注射USP19敲低細(xì)胞的小鼠顯示出無(wú)腫瘤存活率增加，以及腫瘤形成的發(fā)生延遲和轉(zhuǎn)移灶的出現(xiàn)顯著減少，表明腫瘤細(xì)胞侵襲并且傳播受到影響。相比之下，USP19的過(guò)表達(dá)增加了體外和體內(nèi)的細(xì)胞侵襲性，進(jìn)一步驗(yàn)證了作者的發(fā)現(xiàn)。更重要的是，作者證明了USP19催化活性對(duì)于控制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲很重要，并且其分子作用機(jī)制涉及Wnt輔助受體LRP6。最后，作者發(fā)現(xiàn)USP19過(guò)表達(dá)是早期乳腺癌患者復(fù)發(fā)的替代預(yù)后標(biāo)志物。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明USP19可能代表乳腺癌的新治療靶點(diǎn)。

研究?jī)?nèi)容

1.基于遷移的篩選以識(shí)別具有新調(diào)節(jié)功能的泛素化途徑基因? ? ?

????????為了在泛素化途徑中鑒定新的細(xì)胞遷移正調(diào)節(jié)因子，作者進(jìn)行了基于shRNA的功能選擇篩選。一個(gè)針對(duì)400多個(gè)人類泛素化相關(guān)基因的重組慢病毒shRNA文庫(kù)被穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)到乳腺癌細(xì)胞中。功能選擇的方法為將混合種群放入transwell單元的上部隔室，并允許通過(guò)穿孔膜遷移到下部隔室，分離并擴(kuò)增表現(xiàn)出遷移減少的細(xì)胞。作者將得到的細(xì)胞循環(huán)進(jìn)行該方法，直到細(xì)胞失去了大約80%的遷移潛力。在每個(gè)循環(huán)之后，作者通過(guò)PCR擴(kuò)增和基因組DNA的定量測(cè)序來(lái)評(píng)估細(xì)胞群中shRNA的相對(duì)豐度。隨著循環(huán)周期的增加，作者觀察到shRNA的數(shù)量顯著減少，表明選擇過(guò)程是有效的。作為對(duì)照，作者使用了空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系。

????????在選擇過(guò)程之后，作者分析工作流程來(lái)選擇候選基因以進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。作者鑒定出30個(gè)基因，它們的敲低改變了遷移。這些基因中有一半已經(jīng)與遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移或腫瘤發(fā)生相關(guān)，并作為作者篩選的可行性和特異性的證明。在確定的候選者中，作者將注意力集中在去泛素化酶USP19的研究上。

研究結(jié)論：作者通過(guò)篩選，確定了USP19與細(xì)胞遷移有關(guān)

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2.驗(yàn)證USP19作為細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)劑

????????為了驗(yàn)證USP19作為細(xì)胞遷移的潛在調(diào)節(jié)劑，作者建立了穩(wěn)定的MDAMB231細(xì)胞系，這些細(xì)胞系用針對(duì)USP19表達(dá)的shRNA進(jìn)行處理，并成功敲低了USP19的表達(dá)。接下來(lái)，作者使用transwell遷移和傷口愈合試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)USP19敲低對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響。USP19敲低顯著降低了細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞系的遷移潛力。對(duì)傷口愈合試驗(yàn)的分析也表明，USP19敲低細(xì)胞中傷口邊緣細(xì)胞的速度和總位移顯著降低，并且相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，它們的持久性增加。

研究結(jié)論：USP19沉默影響體外細(xì)胞遷移。

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3.敲低USP19可以降低腫瘤侵襲

????????細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性通常與腫瘤細(xì)胞侵襲增加有關(guān)，并且是侵襲性腫瘤細(xì)胞的特征。因此，作者決定研究USP19敲低對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響。為此，作者首先分析了細(xì)胞侵入瓊脂斑點(diǎn)的能力。作者的結(jié)果表明，與對(duì)照細(xì)胞系相比，USP19敲低顯著減少了入侵細(xì)胞的數(shù)量及其總位移。作者接下來(lái)進(jìn)行了集落形成實(shí)驗(yàn)，與USP19沉默的細(xì)胞系相比，對(duì)照細(xì)胞系形成更大的集落，表明在這些條件下，USP19表達(dá)降低的細(xì)胞中的增殖、侵襲和不依賴貼壁的生長(zhǎng)受損。

研究結(jié)論：USP19敲低抑制了體外腫瘤細(xì)胞的侵襲。

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4.敲低USP19可以降低腫瘤侵襲

????????作者用USP19過(guò)表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，然后進(jìn)行傷口愈合試驗(yàn)。與對(duì)照細(xì)胞系相比，USP19過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)間隙覆蓋面積顯著增加。作為對(duì)照，作者過(guò)表達(dá)USP19的催化突變踢和缺少USP19跨膜結(jié)構(gòu)域的突變體。與USP19野生型相比，作者沒有檢測(cè)到這些突變體中細(xì)胞遷移的增加。這一結(jié)果進(jìn)一步支持了USP19是遷移的正調(diào)節(jié)因子的假設(shè)，并提供了證據(jù)表明這種表型取決于其催化活性和亞細(xì)胞定位。接下來(lái)，作者分析了USP19過(guò)表達(dá)對(duì)重組細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲和生長(zhǎng)的影響。當(dāng)將野生型USP19過(guò)表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞系進(jìn)行比較時(shí)，作者觀察到集落面積顯著增加。

研究結(jié)論：USP19野生型過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了MCF7細(xì)胞的遷移和侵襲，另一方面，USP19依賴性的侵襲增加取決于其催化活性和跨膜結(jié)構(gòu)域的存在。

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5.USP19調(diào)節(jié)體內(nèi)侵襲

????????為了進(jìn)一步表征USP19依賴的體內(nèi)細(xì)胞侵襲調(diào)控，作者首先在雌性小鼠的乳腺脂肪墊中皮下注射對(duì)照或USP19沉默的MDAMB231細(xì)胞。腫瘤生長(zhǎng)曲線分析表明，由對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞比源自USP19沉默細(xì)胞的細(xì)胞體積明顯更大。此外，無(wú)腫瘤存活率的Kaplan-Meier曲線表明，表達(dá)USP19 shRNA的細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤較少。其次，作者分析了USP19在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞肺定植中的作用。為此，作者通過(guò)尾靜脈注射接種對(duì)照或USP19沉默的MDAMB231細(xì)胞，并在兩個(gè)月后收獲肺。通過(guò)蘇木精和伊紅染色的肺切片中的人類DNA定量和轉(zhuǎn)移負(fù)荷定量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，USP19敲低抑制了體內(nèi)腫瘤病灶的形成。最后，作者使用MCF7細(xì)胞重復(fù)了相似的探究。作者在雌性小鼠中皮下注射對(duì)照細(xì)胞或表達(dá)USP19的野生型或催化突變體的細(xì)胞。與作者的體外實(shí)驗(yàn)一致，野生型USP19表達(dá)細(xì)胞在所有注射的小鼠中形成腫瘤，而注射表達(dá)催化突變體的細(xì)胞的小鼠沒有顯示出腫瘤生長(zhǎng)的跡象。

研究結(jié)論：USP19對(duì)體內(nèi)定植和腫瘤生長(zhǎng)很重要。此外，作者的結(jié)果表明USP19催化活性和跨膜結(jié)構(gòu)域是其對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的刺激作用所必需的。

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6.USP19調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中的LRP6蛋白水平

????????為了研究USP19影響細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)節(jié)機(jī)制，作者使用數(shù)據(jù)集對(duì)乳腺癌mRNA表達(dá)進(jìn)行了計(jì)算機(jī)分析。作者的結(jié)果表明，USP19的高表達(dá)水平與Wnt通路的激活相關(guān)。這一結(jié)果與之前的觀察結(jié)果一致，表明USP19穩(wěn)定了LRP6，一種Wnt通路輔助受體，并且這種相互作用影響了下游的Wnt信號(hào)?；谶@些結(jié)果，作者分析了USP19基因修飾后LRP6蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。作者的結(jié)果表明，在MDAMB231中沉默USP19后，LRP6蛋白水平下降，而在WT USP19過(guò)量表達(dá)的MCF7細(xì)胞中則增加，但在表達(dá)催化死亡或細(xì)胞質(zhì)突變版本的細(xì)胞中則沒有。為了測(cè)試USP19和LRP6之間的功能關(guān)系，作者隨后分析了LRP6內(nèi)源性沉默對(duì)過(guò)表達(dá)USP19的MCF7細(xì)胞的影響。作者的結(jié)果表明，野生型USP19誘導(dǎo)的遷移增加被LRP6 shRNA穩(wěn)定表達(dá)逆轉(zhuǎn)。

研究結(jié)論：USP19/LRP6信號(hào)通路，而非USP19的表達(dá)水平，是調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞遷移潛力的關(guān)鍵。

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7.USP19在早期乳腺癌患者中表達(dá)的生存分析

????????最后，作者分析了早期乳腺癌患者隊(duì)列研究中的USP19蛋白表達(dá)。Kaplan-Meier圖顯示，USP19的過(guò)表達(dá)與DRFS的頻率明顯降低有關(guān)，而與DFS沒有明顯的相關(guān)性。對(duì)DRFS進(jìn)行多變量分析，并對(duì)其他預(yù)后因素進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)USP19高是DRFS的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因素。

研究結(jié)論：USP19代表了早期乳腺癌患者的一個(gè)新的預(yù)測(cè)因素。

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結(jié)論與討論

????????為了驗(yàn)證USP19作為遷移和侵襲的正調(diào)節(jié)因子的功能，作者進(jìn)行了一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分析USP19在定植和腫瘤形成中的作用。此外，作者發(fā)現(xiàn)USP19過(guò)表達(dá)及診斷與早期乳腺癌患者的復(fù)發(fā)有關(guān)。總的來(lái)說(shuō)，作者的數(shù)據(jù)表明USP19在乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)散中起著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，作者提供了新的證據(jù)，表明USP19可以成為預(yù)后標(biāo)志物和開發(fā)新治療策略的候選者。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41389-021-00318-x