近期，中科院基因組所慈維敏研究員團(tuán)隊(duì)在?Advanced Science?發(fā)表了題為“Single-Cell RNA-seq Reveals a Developmental Hierarchy Super-Imposed Over Subclonal Evolution in the Cellular Ecosystem of Prostate Cancer”的研究成果。通過(guò)對(duì) 14 例未經(jīng)治療的前列腺癌原發(fā)腫瘤進(jìn)行檢測(cè)分析，構(gòu)建了前列腺癌單細(xì)胞圖譜，系統(tǒng)分析了不同亞克隆的進(jìn)化方向，并通過(guò)分析 TCGA 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性和細(xì)胞生態(tài)多樣性與患者的不良預(yù)后相關(guān)。該研究中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Advanced Science

【影響因子】16.806

【檢測(cè)技術(shù)】10x Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

研究背景

前列腺癌（PCa）目前仍是全球男性第二大常見(jiàn)癌癥，自 2000 年起，我國(guó)前列腺癌癥確診患者以每年 12.6% 的增長(zhǎng)率迅速攀升，并且晚期和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的確診率逐年穩(wěn)步攀升，亟需針對(duì)性的治療策略。但腫瘤包含有不同種類的細(xì)胞，它們具有不同的遺傳和表型特性，可在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥過(guò)程中起到不同的促進(jìn)作用，因此需要進(jìn)一步了解前列腺癌異質(zhì)性以幫助醫(yī)務(wù)工作者找到更為有效的治療策略。

研究路線

研究結(jié)果

1、利用單細(xì)胞測(cè)序構(gòu)建前列腺癌腫瘤生態(tài)圖譜

為了解 PCa 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，研究人員利用 10x 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì) 14 例未經(jīng)治療的 PCa 原發(fā)灶樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析獲得 9 種主要的細(xì)胞類型，包括 B 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和一群未定義的細(xì)胞。并發(fā)現(xiàn)在 PCa 患者樣本中，T細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的占比高。

為進(jìn)一步了解 PCa 細(xì)胞間的異質(zhì)性，研究人員利用 inferCNV 分析得到了 20681 個(gè)惡性細(xì)胞和 2802 個(gè)正常的前列腺上皮細(xì)胞，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類分析腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性獲得 4 個(gè)腫瘤細(xì)胞亞群，其中亞型 0 是一類上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣（EMT-like）細(xì)胞，亞型 1 為管腔 A 樣（luminal A-like）細(xì)胞，亞型 2 同事具有管腔 B 樣（luminal A-like）和管腔 C 樣（luminal C-like）細(xì)胞信號(hào)，亞型 3 為基底樣（basal-like）細(xì)胞。為了了解不同患者來(lái)源的樣本中腫瘤細(xì)胞亞克隆情況，研究人員進(jìn)一步分析了這 4 種腫瘤細(xì)胞亞群在每個(gè)樣本中的占比情況，發(fā)現(xiàn)每個(gè)患者的樣本中都有 1-2 種亞型占主導(dǎo)地位，表明在腫瘤進(jìn)化過(guò)程中不同的腫瘤亞克隆會(huì)存在異質(zhì)性的優(yōu)先取向。

2、不同腫瘤亞型和亞克隆內(nèi)腫瘤細(xì)胞周期和發(fā)展階段異質(zhì)性分析

細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，只有一小部分腫瘤細(xì)胞增殖，且 0 亞型的增殖率高于其他 3 個(gè)亞型。研究人員還發(fā)現(xiàn)不同亞克隆和不同患者之間的細(xì)胞增殖狀態(tài)存在很大的異質(zhì)性，在一個(gè)具有代表性的患者中，傾向于 0 亞型的亞克隆比其他亞克隆有更多的增殖細(xì)胞。

進(jìn)一步利用 Monocle 對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行擬時(shí)序分析，結(jié)果顯示發(fā)育層次從亞型 2、3 開(kāi)始，并向亞型1進(jìn)展，表明亞型 2、3 的腫瘤細(xì)胞分化狀態(tài)遠(yuǎn)低于與管腔 A 分化型上皮細(xì)胞表現(xiàn)出高度的相似性的亞型 1。GSVA 分析結(jié)果顯示， EMT、TGFβ 和缺氧通路在亞型 0 中富集，同時(shí)也獲得了亞型 0 與其他亞型共有的代謝通路。值得注意的是，目前較多研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換能夠增強(qiáng)細(xì)胞的干性和轉(zhuǎn)移能力，而本研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與之相一致，即亞型 1 的干性評(píng)分值較低，而亞型 0、2 和 3 的干性評(píng)分較高，表明腫瘤細(xì)胞在亞克隆進(jìn)化過(guò)程中獲得細(xì)胞周期和發(fā)育異質(zhì)性。

3、不同腫瘤細(xì)胞克隆型的表達(dá)程序差異

為了探索驅(qū)動(dòng)不同發(fā)育亞型的潛在分子基礎(chǔ)，我們接下來(lái)使用單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類（SCENIC）來(lái)識(shí)別每種腫瘤亞型中的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。分析發(fā)現(xiàn)每種腫瘤亞型受相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（TF）驅(qū)動(dòng)，并且在各亞型中還發(fā)現(xiàn)了受關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的 marker 基因上調(diào)表達(dá)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)每個(gè)亞型的經(jīng)典標(biāo)記和相關(guān) TF 的表達(dá)也與 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中 PCa 患者隊(duì)列顯著相關(guān)。更重要的是，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性發(fā)育亞型也通過(guò)患者腫瘤切片樣本的免疫組化結(jié)果得到證實(shí)。

4、惡性細(xì)胞中的細(xì)胞可塑性可能與腫瘤微環(huán)境有關(guān)

腫瘤微環(huán)境可能會(huì)驅(qū)動(dòng)不同克隆型或腫瘤亞型的可塑性，因此研究人員利用 cellChat 分析了細(xì)胞之間的通訊網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是主要的通訊樞紐。此外，中期因子（Midkine）、巨噬細(xì)胞遷移和抑制因子（MIF）和VISFATIN /煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）信號(hào)通路是最多的相互作用通路。

為了評(píng)估腫瘤內(nèi)亞克隆是否通過(guò)與腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中其他空間共定位細(xì)胞群的通信來(lái)塑造其發(fā)育亞型，將腫瘤細(xì)胞分別評(píng)估為亞克隆或亞型。值得注意的是，亞型 0 細(xì)胞無(wú)論是細(xì)胞群內(nèi)還是與其他細(xì)胞群之間的通訊強(qiáng)度均較弱。這些結(jié)果與已知的 EMT 可塑性一致，包括喪失細(xì)胞-細(xì)胞間的強(qiáng)烈接觸、細(xì)胞極性和不動(dòng)性。由于亞型 0 腫瘤細(xì)胞占比顯示出腫瘤間異質(zhì)性，因此研究人員進(jìn)一步對(duì)其他患者數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象具有普遍性。隨后，研究人員分析了 PCa 患者中不同腫瘤克隆型與其他基質(zhì)細(xì)胞間的通訊強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞之間的通訊強(qiáng)度明顯不同，進(jìn)一步分析不同腫瘤亞克隆內(nèi)部的細(xì)胞通訊強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)不同亞克隆中 MK 和 MIF 信號(hào)通路存在顯著差異，這些都表明不同的基質(zhì)細(xì)胞類型可以與不同的腫瘤亞克隆相互作用，從而解釋不同的腫瘤行為。

5、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性和細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)多樣性與不良預(yù)后相關(guān)

為了評(píng)估了腫瘤內(nèi)細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)異質(zhì)性和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性是否可能推動(dòng)疾病進(jìn)展，研究人員分別建立了兩套打分系統(tǒng)以量化腫瘤異質(zhì)性的不同方面。首先，研究人員使用 CIBERSORTx 算法，根據(jù)本研究中 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集對(duì) TCGA 隊(duì)列中 4 種腫瘤轉(zhuǎn)錄亞型的組成進(jìn)行去卷積，無(wú)監(jiān)督聚類分析發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)群，其中1群中亞型 0 惡性細(xì)胞比例更高，而 2 群中亞型 1、2 和 3 的比例則更高。此外，1 群中患者的無(wú)進(jìn)展生存期明顯低于 2 群中的患者，這表明轉(zhuǎn)錄亞型 0 與較差的預(yù)后相關(guān)。考慮到腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞類型之間的廣泛相互作用，研究人員假設(shè)腫瘤細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)的多樣性可能會(huì)影響腫瘤亞型的異質(zhì)性，并基于此利用香農(nóng)多樣性指數(shù)（SHDI）來(lái)評(píng)估腫瘤亞型異質(zhì)性與腫瘤生態(tài)系統(tǒng)細(xì)胞多樣性之間的相關(guān)性。分析發(fā)現(xiàn)腫瘤亞型異質(zhì)性與腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)胞多樣性之間存在正相關(guān)，表明腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的細(xì)胞復(fù)雜性可能通過(guò)細(xì)胞通訊塑造腫瘤的亞型成分，從而影響患者的生存。此外，研究人員還利用 CIBERSORTx 推斷的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)胞多樣性進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類分析，并確定了兩個(gè)集群 Div-High 和Div-Low。Div-High 比 Div-Low 具有更大的細(xì)胞多樣性，并且上皮細(xì)胞顯著減少，但內(nèi)皮細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著增加。值得注意的是，Div-High 組患者的無(wú)進(jìn)展生存期明顯低于 Div-Low 組患者，表明較高的腫瘤細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)多樣性也與較差的預(yù)后相關(guān)?？偠灾?，較高比例的亞型 0 腫瘤細(xì)胞和較高的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)細(xì)胞多樣性與較差的預(yù)后相關(guān)。

研究結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì) 14 名未經(jīng)治療的 PCa 患者進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建了 PCa 患者的單細(xì)胞圖譜，并將細(xì)胞發(fā)展階段映射到腫瘤亞克隆進(jìn)化上。同時(shí)研究人員還在 PCa 患者中鑒定出 4 種不同的腫瘤亞克隆。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)不同亞克隆與腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的其他細(xì)胞類型顯示出不同的通信強(qiáng)度，這可能會(huì)調(diào)節(jié)亞克隆的不同轉(zhuǎn)錄亞型。此外，通過(guò)整合 TCGA 數(shù)據(jù)，研究人員還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性和細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)多樣性都與預(yù)后不良的特征相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

Ge Guangzhe, Han Yang, Zhang Jianye et al. Single-Cell RNA-seq Reveals a Developmental Hierarchy Super-Imposed Over Subclonal Evolution in the Cellular Ecosystem of Prostate Cancer.?Adv Sci?(Weinh),? 2022, 9:? e2105530.