質(zhì)譜流式技術(shù)（Mass Cytometry）在藥物開(kāi)發(fā)和生物藥物表征中的潛力巨大。質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)將質(zhì)譜技術(shù)與流式細(xì)胞儀相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的生化成分進(jìn)行深入研究，幫助我們理解疾病機(jī)制，驗(yàn)證藥物的效果，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)以及增強(qiáng)生物制藥質(zhì)量控制。這在生物藥物表征中非常有用，它可以幫助解決以下一些問(wèn)題：

單細(xì)胞層次的分子表征：傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)通常需要大量的樣本以獲取可靠的結(jié)果，而質(zhì)譜流式技術(shù)則可以分析單個(gè)細(xì)胞的生化成分，這可以幫助我們更深入地理解細(xì)胞的生物學(xué)特性。

生物分子的定量分析：質(zhì)譜流式技術(shù)可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物分子進(jìn)行定量分析，包括蛋白質(zhì)、代謝物和其他生物分子。

細(xì)胞異質(zhì)性的研究：細(xì)胞群體中的細(xì)胞并非完全相同，它們之間的差異可能影響疾病的發(fā)展和治療的效果。質(zhì)譜流式技術(shù)可以幫助我們研究這種細(xì)胞異質(zhì)性。

百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式細(xì)胞儀（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于單細(xì)胞質(zhì)譜分析，該平臺(tái)能夠完成包括單細(xì)胞捕獲、cDNA合成、實(shí)時(shí)定量PCR分析、目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增以及質(zhì)譜流式細(xì)胞分析。

與傳統(tǒng)熒光流式相比，質(zhì)譜流式的最大改變是檢測(cè)指標(biāo)從熒光標(biāo)簽到金屬標(biāo)簽。傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)用熒光基團(tuán)作為報(bào)告分子，通過(guò)對(duì)發(fā)射光強(qiáng)度定量以確定目標(biāo)分子的表達(dá)量。質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)使用單一分子量的穩(wěn)定鑭系金屬代替熒光基團(tuán)作為報(bào)告分子，元素質(zhì)譜分析儀能夠通過(guò)分子量準(zhǔn)確區(qū)分不同原子質(zhì)量，并且不同鑭系金屬質(zhì)量沒(méi)有信號(hào)重疊，增加了定量的準(zhǔn)確性。

一、抗體標(biāo)記

在質(zhì)譜流式實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)好抗體panel后，可以直接購(gòu)買金屬標(biāo)簽標(biāo)記好的抗體，也可以購(gòu)買流式抗體自己標(biāo)記金屬標(biāo)簽。2008年，Angew Chem int ed Engl雜志上報(bào)道了多倫多大學(xué)一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的用于ICP-MS檢測(cè)的一類新型元素標(biāo)簽。金屬標(biāo)簽是一種含有多種金屬螯合配體的水溶性聚合物，該聚合物含一個(gè)有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的末端，用于與抗體Fc部分的半胱氨酸-SH基團(tuán)偶聯(lián)（圖1）。通過(guò)-SH基團(tuán)（由二硫鍵的選擇性還原產(chǎn)生）將標(biāo)簽連接到抗體上，要比將標(biāo)簽隨機(jī)共價(jià)連接到賴氨酸的氨基上更容易保持抗體的活性。

Maxpar X8抗體標(biāo)記試劑盒（Fluidigm）是當(dāng)前市售的金屬螯合聚合物（Metal conjugated polymer，MCP），使用硫醇-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)方法將MCP與IgG抗體（Abs）共價(jià)偶聯(lián)。聚合物上的馬來(lái)酰亞胺端基允許在部分鏈間二硫鍵還原條件下選擇性地偶聯(lián)免疫球蛋白重鏈鉸區(qū)的反應(yīng)性硫醇基團(tuán)（圖2）。

但該方法依賴于半胱氨酸殘基的存在和Abs還原步驟，因此某些類別的Abs（例如，IgMs和IgA）以及缺乏半胱氨酸殘基的生物分子（例如，肽，凝集素和激素）無(wú)法使用此方法有效標(biāo)記。近年來(lái)，也有許多研究開(kāi)發(fā)新的偶聯(lián)策略，用于標(biāo)記各種生物分子和親和試劑。例如，有研究人員使用一類新的疊氮或反環(huán)辛烯末端的MCPs與無(wú)銅（I）應(yīng)變促進(jìn)的烷基-疊氮環(huán)化反應(yīng)或四嗪-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，其中具有-NH2功能團(tuán)的生物分子分別被二苯環(huán)辛烯或四嗪分子選擇性地激活。這種方法能夠產(chǎn)生高度敏感和特異的金屬標(biāo)記的IgG、IgMs、小肽和凝集素，應(yīng)用于免疫分型和糖生物學(xué)（圖3）。

目前常見(jiàn)的質(zhì)譜流式金屬標(biāo)簽是基于1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸等配位基團(tuán)的聚合物金屬標(biāo)簽，每條聚合物鏈上僅連有20-50個(gè)金屬原子，相當(dāng)于每個(gè)抗體上連有150-200個(gè)金屬原子，無(wú)法實(shí)現(xiàn)低豐度標(biāo)志物的檢測(cè)。近年來(lái)也有新的研究結(jié)果報(bào)道新金屬同位素載體的開(kāi)發(fā)。例如，有研究團(tuán)隊(duì)將稀土、鋯和鉿等金屬元素通過(guò)溶脹的方法摻雜到聚苯乙烯納米顆粒中，并進(jìn)行抗體偶聯(lián)，制備了一系列質(zhì)譜流式金屬標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單核細(xì)胞（MNCs）的單細(xì)胞高靈敏多指標(biāo)檢測(cè)。有研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一類基于介孔卟啉框架（MPF）納米顆粒的新型金屬標(biāo)記體系，將非鑭系金屬如Pd、Sn、W和Pt成功應(yīng)用到CyTOF檢測(cè)中，有望成為顯著擴(kuò)大CyTOF檢測(cè)通道的有力工具。

總的來(lái)說(shuō)，用于質(zhì)譜流式金屬標(biāo)記的聚合物必須滿足幾個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。首先，聚合物應(yīng)該有一個(gè)相對(duì)較窄的鏈長(zhǎng)分布，這樣每個(gè)標(biāo)記的抗體都攜帶類似數(shù)量的金屬離子。第二，金屬的結(jié)合方式必須使它們?cè)趦?chǔ)存或應(yīng)用過(guò)程中不發(fā)生交換。第三，該聚合物必須包含用于抗體連接的官能團(tuán)。最后，該聚合物必須是水溶性的，因?yàn)樯餃y(cè)定是在水介質(zhì)中進(jìn)行的。雖然含有聚氨基甲酸酯螯合劑的金屬螯合聚合物是為結(jié)合鑭系元素而設(shè)計(jì)的，具有很高的水溶性，但鑭系元素以外的一些金屬離子的螯合劑是相當(dāng)疏水的。帶有疏水螯合劑的金屬螯合聚合物需要額外的增溶分子來(lái)使其具有水溶性。

金屬標(biāo)簽標(biāo)記抗體后，需要通過(guò)測(cè)量280 nm處的吸光度來(lái)量化共軛抗體的回收率以及對(duì)偶聯(lián)抗體滴定確定最佳的染色濃度?？贵w滴定的本質(zhì)是在抗體的特異性與非特異性結(jié)合中尋找最佳的平衡。過(guò)低濃度的抗體無(wú)法飽和或有效結(jié)合抗原位點(diǎn)，導(dǎo)致染色不均或信號(hào)較弱；而過(guò)高濃度的抗體引起低親和非特異性結(jié)合效率的提升，此時(shí)陰性、陽(yáng)性群體信號(hào)均增加，但分群效果下降。通過(guò)抗體滴定工作曲線，選用不引起背景明顯提升且信噪比最佳的染色條件，可在節(jié)約抗體用量的同時(shí)降低背景干擾，提升數(shù)據(jù)質(zhì)量。

二、樣品barcoding

質(zhì)譜流式實(shí)驗(yàn)中，為了在關(guān)鍵樣品之間進(jìn)行最精確的比較，可以對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行條形碼編碼（barcoding），使多個(gè)樣品能夠合并以進(jìn)行下游染色和采集。這些策略使用一組金屬的不同組合，并且這些組合中的每一個(gè)都用作單個(gè)樣品的唯一條形碼。用這些條形碼金屬對(duì)樣品進(jìn)行染色后，可以將多個(gè)樣品匯集到同一管中，然后用抗體混合物進(jìn)行染色。數(shù)據(jù)收集后，通過(guò)識(shí)別具有特定條形碼的每個(gè)細(xì)胞，在分析之前對(duì)每個(gè)相應(yīng)的樣品進(jìn)行去卷積。質(zhì)譜流式的barcode試劑是基于mDOTA（maleimido-mono-amide- DOTA）分子改造的，mDOTA是一個(gè)雙功能化合物，一端可以螯合金屬離子，一端則可以和細(xì)胞中蛋白上的自由巰基以共價(jià)鍵形式結(jié)合（圖4）。

在質(zhì)譜流式儀器中共價(jià)鍵被打碎后，每種鑭系金屬元素的峰即可形成有和無(wú)兩種情況，使用的鑭系金屬元素螯合的mDOTA試劑的種類越多，最終可組成的條形碼種類越多，使用7種鑭系金屬元素螯合mDOTA試劑，可以組成2的7次方種條形碼，即可以同時(shí)標(biāo)記128個(gè)樣品（圖5）。

Cell-ID? 20-Plex Pd Barcoding Kit是Fluidigm公司開(kāi)發(fā)的樣品標(biāo)記試劑盒，可以通過(guò)6個(gè)金屬標(biāo)簽的組合（?102, 104, 105, 106, 108, 110）對(duì)20個(gè)樣品進(jìn)行標(biāo)記（圖6）。

經(jīng)過(guò)barcode試劑標(biāo)記的樣品經(jīng)過(guò)質(zhì)譜流式分析后，收集的數(shù)據(jù)是包含了所有復(fù)用樣品的綜合數(shù)據(jù)，因此必須進(jìn)行解碼，以便進(jìn)行下游分析。解碼器軟件（Debarcoder）可以對(duì)樣品進(jìn)行解碼，并為每個(gè)條形碼樣品創(chuàng)建單獨(dú)的FCS文件，用于下游分析。復(fù)合的文件包含了理想的單細(xì)胞事件和不理想的事件，如碎片、跨樣本聚集和跨樣本離子融合。最佳的解碼結(jié)果是準(zhǔn)確地分配最大數(shù)量的理想事件，并在解碼后的輸出文件中盡量不包含不希望或不確定的事件（圖7）。

當(dāng)一個(gè)文件被加載到Debarcoder時(shí)，通過(guò)將其三個(gè)最亮的Pd同位素的身份與相應(yīng)的條形碼鍵相匹配。任何少于3個(gè)Pd染色的事件或與任何其他事件關(guān)聯(lián)性差的事件都會(huì)從數(shù)據(jù)中刪除。解碼器提供了兩個(gè)計(jì)算參數(shù)用于從解碼后的數(shù)據(jù)中消除不需要的事件，Barcode Separation（BcS）和Mahalanobis Distance（MD）。BcS是對(duì)具有第三和第四高強(qiáng)度的同位素之間rescaled強(qiáng)度差異的測(cè)量。rescaled是通過(guò)將每個(gè)Pd強(qiáng)度除以條形碼中最亮的Pd的平均值+2SD值來(lái)計(jì)算的。使用rescaled強(qiáng)度可以糾正整體染色強(qiáng)度的差異，這可能是由于細(xì)胞對(duì)Pd吸收的特異性變化或條形碼樣品中細(xì)胞數(shù)量的變化造成的。MD量化了六維Pd強(qiáng)度空間中一個(gè)事件和其分配的條形碼群體分布之間的距離。細(xì)胞碎片聚集等事件在Pd強(qiáng)度空間中偏離單細(xì)胞群的中心，導(dǎo)致MD值升高。然而，條形碼樣品包含一些有效的細(xì)胞，它們可能在Pd吸收方面與樣品中的大多數(shù)事件不同，這樣的事件也會(huì)被嚴(yán)格的MD所過(guò)濾。因此，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)謹(jǐn)慎使用MD作為輔助過(guò)濾器。最好是使用BcS進(jìn)行初級(jí)過(guò)濾，只在特殊情況下使用MD作為二級(jí)過(guò)濾。

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