??????大家好啊，我是冠男。今天要給大家分享的是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的一項(xiàng)技術(shù)：細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)（包括細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞傳代，細(xì)胞鋪板及細(xì)胞凍存）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)是做生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的人幾乎都會(huì)遇見(jiàn)的一項(xiàng)技術(shù)。

????體外培養(yǎng)（in vitro culture）就是將活體結(jié)構(gòu)成分或活的個(gè)體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長(zhǎng)和發(fā)育的方法，主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)及器官體外培養(yǎng)，下面主要介紹的是細(xì)胞體外培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價(jià)值，比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過(guò)程中很多是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的：基因工程乙肝疫苗很多是以CHO細(xì)胞作為載體，雜交瘤單克隆抗體，基因工程抗體也離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因治療、體細(xì)胞治療也要經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程才能實(shí)現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān)。筆者總結(jié)了一些細(xì)胞相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)（包括細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞傳代，細(xì)胞鋪板及細(xì)胞凍存）。下面我將會(huì)從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)解析三個(gè)方面來(lái)進(jìn)行介紹。

細(xì)胞復(fù)蘇

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶，離心管，垃圾桶，槍頭，紫外滅菌，提前準(zhǔn)備37℃溫水。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1取10/15ml離心管于試管架，加入2-9ml培養(yǎng)基。

2解凍細(xì)胞（37-40°化凍時(shí)間<1min）

3轉(zhuǎn)移細(xì)胞

4離心1000rpm，5min，Room temperature

5棄去上清培養(yǎng)基，加入1ml培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中（標(biāo)記細(xì)胞名稱，復(fù)蘇時(shí)間，細(xì)胞代數(shù)等）

6十字交叉法混勻，鏡下觀察，轉(zhuǎn)移至恒溫恒濕（37℃，5% CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

實(shí)驗(yàn)解析：

細(xì)胞復(fù)蘇主要包括細(xì)胞解凍——離心去除DMSO——細(xì)胞轉(zhuǎn)移培養(yǎng)三個(gè)步驟。

在這其中，細(xì)胞解凍尤為關(guān)鍵，解凍時(shí)越快越好，放入37℃水浴鍋的同時(shí)快速晃動(dòng)，加速解凍時(shí)間，一般解凍時(shí)間小于1min。解凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的冰晶碎片損傷細(xì)胞。

DMSO極易透過(guò)細(xì)胞膜，且會(huì)抑制細(xì)胞增殖。如果細(xì)胞對(duì)DMSO敏感，可以適度增加離心時(shí)間和離心次數(shù)。

細(xì)胞傳代

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶，離心管，垃圾桶，10%FBS培養(yǎng)基，PBS，胰酶等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.鏡下觀察細(xì)胞密度及形態(tài)，待密度達(dá)到80-90%時(shí)進(jìn)行傳代

2.取出細(xì)胞，PBS清洗*2

3.取適量胰酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞呈白霧狀時(shí)終止消化

4. 2倍體積培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至10ml離心管

5.1000g，5min，RT離心

6.棄去上清，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1：2-1：4轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿

實(shí)驗(yàn)解析：

細(xì)胞傳代主要包括細(xì)胞清洗——胰酶消化——細(xì)胞離心轉(zhuǎn)移等幾個(gè)步驟

在這其中，作者認(rèn)為比較重要的是胰酶消化細(xì)胞這一個(gè)步驟。在進(jìn)行消化前，首先需要用槍頭洗干凈清洗細(xì)胞的PBS（PBS殘留可能會(huì)稀釋胰酶，影響消化）。其次，可根據(jù)細(xì)胞的習(xí)性選擇胰酶類型（是否添加EDTA，EDTA可以螯合+2價(jià)金屬離子，如Ca2+,Mg2+等，降低細(xì)胞粘連，從而加速細(xì)胞脫落的過(guò)程）。最后很多同學(xué)在細(xì)胞消化時(shí)都喜歡計(jì)時(shí)，但筆者感覺(jué)計(jì)時(shí)其實(shí)并不算非常的準(zhǔn)確，因?yàn)橐让傅幕盍κ呛铜h(huán)境的溫度有關(guān)，在冬天消化和在夏天消化無(wú)論如何都會(huì)存在一些偏差。筆者常用的方法為不停的來(lái)回晃動(dòng)細(xì)胞，觀測(cè)細(xì)胞是否出現(xiàn)白霧，然后可以不定時(shí)的適當(dāng)取一些消化中的胰酶輕輕吹打細(xì)胞，觀察細(xì)胞是否易于脫落，防止細(xì)胞消化過(guò)度（但是有一些細(xì)胞非常的薄，需要仔細(xì)觀察）。

細(xì)胞鋪板

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶，細(xì)胞板、離心管，垃圾桶，培養(yǎng)基，PBS，胰酶等。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.鏡下觀察細(xì)胞密度及形態(tài)，待密度達(dá)到80-90%時(shí)傳代

2.取出細(xì)胞PBS（5ml）洗*2

3.2ml胰酶消化，細(xì)胞呈白霧狀

4.2倍體積培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至10ml離心管

5.1000g，5min，RT離心（這些步驟同細(xì)胞傳代）

6.1-3ml重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)

計(jì)數(shù)四個(gè)角，公式C=a/4*104

7.鋪板/傳代

96孔板6-8*103，12孔板1*105，6孔板2*105，具體參照實(shí)驗(yàn)情況

細(xì)胞鋪板過(guò)程中比較關(guān)鍵的是細(xì)胞的計(jì)數(shù)，然后計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)化為每孔細(xì)胞數(shù)（每孔具體加多少微/毫升細(xì)胞等）。

細(xì)胞計(jì)數(shù)記細(xì)胞計(jì)數(shù)板的四角，遵循計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右原則，計(jì)數(shù)公式為：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/mL = 4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×10 000×稀釋倍數(shù)。

舉個(gè)栗子：假設(shè)我現(xiàn)在四個(gè)大格子細(xì)胞總數(shù)是400（1ml稀釋），然后我要鋪一個(gè)6孔板，每個(gè)孔鋪2*105個(gè)細(xì)胞。那么依據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的公式，現(xiàn)在我這1ml細(xì)胞稀釋液中共有細(xì)胞1000 000（1*106）個(gè)/ml。那我設(shè)我取x ml細(xì)胞就是2*105個(gè)細(xì)胞。這樣得到2*105=1*106 × X，得出X=0.2 ml，所以6孔板中每孔加入200μl細(xì)胞懸液。

好像講的有點(diǎn)亂，大家可以多看兩遍，參悟一下（手動(dòng)狗頭）。

這里有一些其它朋友計(jì)數(shù)的經(jīng)驗(yàn)，也可以參考一下：

https://zhuanlan.zhihu.com/p/386579051

細(xì)胞凍存

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：培養(yǎng)皿，凍存管、離心管，垃圾桶（干濕分離），槍頭，培養(yǎng)基，PBS，胰酶，血清，DMSO等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.鏡下觀察細(xì)胞密度及形態(tài)，待密度達(dá)到80-90%時(shí)傳代

2.取出細(xì)胞PBS（5ml）洗*2

3.2ml胰酶消化，細(xì)胞呈白霧狀

4.2倍體積培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至10ml離心管

5.1000g，5min，RT離心（此步驟前同細(xì)胞傳代）

6.900μl重懸加入100μlDMSO

7.異丙醇凍存盒-80℃過(guò)夜凍存，或梯度凍存4℃ 10-30min，-20℃ 30-1h，-80℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)移至液氮中

實(shí)驗(yàn)解析：

細(xì)胞凍存主要包括細(xì)胞消化及細(xì)胞凍存等幾個(gè)步驟

消化步驟注意事項(xiàng)同前所述。

細(xì)胞凍存需要注意的是在第五步離心之后，加入DMSO（DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，延緩溫度下降速度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用）凍存液時(shí)，DMSO與細(xì)胞培養(yǎng)液融合時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的熱，所以需要快速吹打，減少細(xì)胞損傷。然后凍存時(shí)如果有凍存盒，細(xì)胞可以放入凍存盒（一般含有異丙醇，起到程序性降溫的作用）中直接放入-80℃冰箱，沒(méi)有凍存盒可以使用梯度降溫的方法，如前所述。

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本文作者：LGN

審核：小豬

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???????本文主要分享了一些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)的基礎(chǔ)的知識(shí)。作者能力有限，一些更深層次的內(nèi)容歡迎大家在討論區(qū)補(bǔ)充，也歡迎有相關(guān)研究方向的學(xué)者一起討論交流，謝謝大家！