散文網(wǎng) » 生活 »日常 » 最全免疫組化實(shí)驗(yàn)避坑指南，花樣百出的問題一次解決~

最全免疫組化實(shí)驗(yàn)避坑指南，花樣百出的問題一次解決~

2023-06-14 20:20 作者:科研根號(hào)三 0人讀過 | 我要投稿

自從免疫學(xué)摘得2018年的諾獎(jiǎng)后，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)就成為了SCI文章進(jìn)階高分期刊的最佳輔助。但是做過免疫組化實(shí)驗(yàn)的人都知道，看似容易的實(shí)驗(yàn)過程，但是其花樣百出的問題總是讓我們的精神備受摧殘。

檢測(cè)結(jié)果陰性、非特異性染色、染色強(qiáng)度不夠、著色不均、脫片、干片等，這些最常見的實(shí)驗(yàn)問題點(diǎn)，今天一次性匯總解決方式，祝大家都能做出滿意的結(jié)果！

文末有整理組化實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)資源包，有需要的可以自行去文末下載！

1、標(biāo)本的固定

常見問題：

組織固定不及時(shí)或不完全固定，HE染色細(xì)胞核發(fā)灰模糊，對(duì)比不鮮明；免疫組化染色結(jié)果不理想，通常組織離體2h后抗原完全丟失。

?案例示范1

?案例示范2

解決建議：

① 組織離體后盡快固定，組織塊大小為15×15×5mm，切開固定效果好；

② 固定液以10％中性福爾馬林緩沖液為佳；

③ 固定時(shí)間在4h-48h之間，長(zhǎng)時(shí)間固定會(huì)影響抗原決定簇的暴露，產(chǎn)生陰性結(jié)果；

④ 固定液的量要超過組織體積5倍以上。

2、標(biāo)本的取材，脫水，浸蠟

常見問題：

如果組織脫水、浸蠟不充分，蠟塊會(huì)出現(xiàn)組織收縮凹陷，而且在免疫組化熱抗原修復(fù)操作時(shí)會(huì)容易脫片。

解決建議：

① 梯度酒精脫水盡量徹底充分；

② 二甲苯透明時(shí)間不宜長(zhǎng)，1～3h為佳，透明過度會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)硬發(fā)脆；

③ 浸蠟應(yīng)選擇低熔點(diǎn)的石蠟，浸蠟應(yīng)充分。

3、標(biāo)本的切片，撈片，烤片

常見問題：

切片太厚，有刀痕，有褶皺，脫片。

?案例示范1

?案例示范2

解決建議：

① 切片厚度視組織而定，如同淋巴結(jié)、腎等需要比較?。ú怀^3um），腦組織需要較厚（尤其是取新鮮標(biāo)本冰凍制片時(shí)），常規(guī)都要6-8um最佳，冰凍可切至10um；其他一般如胃腸道、肝膽等等組織，2-4um均可,太厚易掉片，細(xì)胞重疊，影響觀察。切片角度和刀片新舊程度對(duì)切片效果的影響較大，切片角度視切片機(jī)型號(hào)而異；新刀片容易切出完好的切片。

② 撈片要求達(dá)到無皺折、無氣泡，水溫宜在40℃左右。

③ 粘片時(shí)需準(zhǔn)備蛋白甘油，蛋白甘油由雞蛋蛋清和甘油調(diào)配而成，比例為1：1。?先將一滴蛋白甘油涂抹在干凈的載玻片上，然后用載玻片從水中將展好的蠟片撈起，平放入烘箱內(nèi)進(jìn)行烘干。或者玻片用防脫片或多聚賴氨酸處理，以增強(qiáng)粘附性。

④ 烘干溫度為50℃，時(shí)間為12～24h。

4、標(biāo)本的脫蠟不完全

常見問題：

脫蠟不全,組織出現(xiàn)異染現(xiàn)象，異染現(xiàn)象一般是蘇木素著色不佳，HE染色沒有選擇性，染色不均勻。有的是伊紅染不上。

解決建議：

根據(jù)不同的室溫，調(diào)節(jié)脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟

5、抗原修復(fù)

抗原修復(fù)是免疫組化中不可忽略的關(guān)鍵步驟。原因是組織經(jīng)福爾馬林等固定液固定和石蠟包埋后，抗原決定簇與核酸易發(fā)生交聯(lián)，引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致抗原決定簇被封閉，是抗原與抗體結(jié)合點(diǎn)減少，從而令抗原抗原的陽性檢測(cè)率及著色強(qiáng)度相對(duì)減弱。這種交聯(lián)在高溫加熱或是蛋白酶水解作用下會(huì)發(fā)生可逆反應(yīng)，恢復(fù)蛋白的原有構(gòu)象，這一過程就是抗原修復(fù)。

常見問題：

陽性檢測(cè)率及著色強(qiáng)度相對(duì)減弱。

?案例示范

經(jīng)驗(yàn)分享：

① 抗原修復(fù)緩沖液有多種，常用的則為檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），EDTA緩沖液（pH8.0-9.0），Tris/Tris-EDTA緩沖液（pH9.0-10.0），或者胰酶法（pH3.5±0.2）；?

② 修復(fù)液的不同PH值對(duì)染色結(jié)果的影響比較大；

③ 沒有一種抗原修復(fù)緩沖液可以適用于所有抗原；

④ 大部分抗原在修復(fù)液pH8.0-9.0的范圍值可以獲得一個(gè)普遍較好的修復(fù)效果，所以堿性緩沖液應(yīng)用普遍些。

6、封閉

常見問題：

① 封閉時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致陽性信號(hào)減弱甚至出現(xiàn)假陰性；

② 封閉時(shí)間不足，會(huì)導(dǎo)致背景增強(qiáng)甚至出現(xiàn)假陽性。

?案例示范

解決建議：

① 根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況選擇合適的封閉試劑和封閉時(shí)間。

② 根據(jù)二抗系統(tǒng)中是否含有生物素而選擇封閉劑。

③ 無生物素的二抗系統(tǒng)可以不使用封閉劑，如Immunoway的RS0011通用型二抗。

④ 卵白素類的二抗系統(tǒng)需要根據(jù)生物素的種類選擇相應(yīng)的封閉劑在一抗前處理組織切片。

⑤ 封閉血清一般是和二抗同一來源，可封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗的來源一致。

7、洗滌

?案例示范

解決建議：

進(jìn)行充分洗滌。

8、干片

?案例示范

解決建議：

加入Tween-20的緩沖液能夠更好地防止切片干燥。

9、邊緣效應(yīng)

?案例示范

解決建議：

組織切片與玻片黏貼牢固，試劑完全覆蓋組織防止干片，加入Tween-20的緩沖液能夠更好地防止邊緣效應(yīng)。

10、一抗的選擇

免疫組化耗時(shí)長(zhǎng)，步驟繁多，為了得到特異性染色，獲得可靠結(jié)論，選擇合適的一抗十分關(guān)鍵。基本原則是選擇選擇特異性強(qiáng)，靈敏度高，背景低的抗體，結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)再現(xiàn)性良好的抗體。

抗體特異性

常見問題：

抗體特異性差，定位不準(zhǔn)確。

?案例示范1

解決建議：

抗體的特異性是選擇抗體最重要的原則，不同抗體特異性不同，組織特異性，細(xì)胞特異性，細(xì)胞亞定位的特異性需都準(zhǔn)確。

抗體的染色強(qiáng)度

常見問題：

檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)弱陽性。

解決建議：

適當(dāng)調(diào)整抗體稀釋比，或者選擇染色強(qiáng)度高，高親和力的抗體。

抗體稀釋比的影響

常見問題：

染色結(jié)果出現(xiàn)非特異性染色或者是低背景。

?案例示范

解決建議：

當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)非特異性染色或者有背景時(shí)，可以適當(dāng)調(diào)整一抗的稀釋比例進(jìn)行改善，特異性強(qiáng)的抗體檢測(cè)結(jié)果不易受稀釋比例的影響。

一抗孵育條件

常見問題：

孵育條件對(duì)染色結(jié)果有影響。

?案例示范

解決建議：

孵育條件對(duì)染色結(jié)果略有影響，需篩選合適的孵育條件。

11、不同組織的影響

常見問題：

染色結(jié)果與預(yù)期不符，檢測(cè)陰性或者弱陽性。

?案例示范

解決建議

設(shè)置陽性組織切片的對(duì)照，因?yàn)橥坏鞍自诓煌M織中的表達(dá)會(huì)有很大的差異。

12、二抗的選擇

常見問題：

使用不同的二抗顯色系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，可能會(huì)有弱陽性結(jié)果。

?案例示范

解決建議：

使用多聚物酶標(biāo)記二抗比普通的HRP直標(biāo)二抗靈敏度更高，背景更干凈，對(duì)比更明顯。

13、DAB顯色

DAB絮狀或團(tuán)狀沉積

常見問題：

產(chǎn)生深棕至黑色的DAB絮狀或團(tuán)狀沉積于組織切片上。

?案例示范

解決建議：

① 現(xiàn)配現(xiàn)用：因?yàn)镈AB顯色液配置好了之后極容易產(chǎn)生DAB的沉積，從而導(dǎo)致樣本上會(huì)出現(xiàn)深棕色的絮狀沉淀，干擾結(jié)果的判定。

② 顯色時(shí)間：所有說明書上的顯色時(shí)間均為一個(gè)范圍，有的反應(yīng)迅速的30s-3min，有的反應(yīng)緩慢的3-20min，應(yīng)該靈活調(diào)整，最好是滴加了DAB顯色液后置于顯微鏡下控制顯色時(shí)間。

③ 顯示時(shí)間技巧：可選擇一張陽性的片子，用計(jì)時(shí)器精確計(jì)時(shí)在顯微鏡下判斷出具體時(shí)間后，再對(duì)所有片子進(jìn)行顯色，采用相同的時(shí)間來界定。一般如果抗體濃度適宜，操作無誤，10分鐘內(nèi)肯定能夠顯色，如果超過該時(shí)間，說明一抗比例不夠或者封閉太久等等原因。顯色時(shí)間越短，則說明抗體濃度高或抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)，需下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時(shí)間

信號(hào)偏弱

常見問題：

信號(hào)偏弱。

?案例示范

解決建議：

適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，滴加了DAB顯色液后置于顯微鏡下控制顯色時(shí)間。

14、蘇木素使用原則

① 不同的蘇木素配方的染色時(shí)間各有不同，配置的新舊程度染色時(shí)間也不同。

② 國(guó)際上常用的為Harris蘇木素，因?yàn)榕浞街泻?，通常還需要進(jìn)行分化，返藍(lán)的步驟，但顏色亮麗。

③ 改良的Mayer蘇木素配方不需要分化，時(shí)間可以根據(jù)配置的時(shí)間調(diào)整染色時(shí)間15s-2min。

15、免疫組化的結(jié)果分析

①對(duì)照組必設(shè)。如陰性、陽性及自身對(duì)照。

從以下表中可知，只有6、7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義。

1-5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定抗體的特異性或因ICH技術(shù)操作存在錯(cuò)誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義，則必須重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換用抗體。

②陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。

在 40 倍光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的 10 個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組 3-6 張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。

③灰密度分析法。

通過在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j 進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。

④分級(jí)法。

免疫組化的半定量一般分為三級(jí)：弱（+），中（++），強(qiáng)（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強(qiáng)（+++）=3。至少隨機(jī)觀察5-10個(gè)HPF。然后根據(jù)（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3計(jì)算出數(shù)值；總數(shù)值1.5者為(+++)。