Fast T4 DNA Ligase丨快速T4 DNA連接酶使用方法說明
T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）的主要功能是連接DNA分子的斷裂端。在DNA復(fù)制、重組或修復(fù)過程中，DNA鏈可能會(huì)發(fā)生斷裂或切口，T4 DNA連接酶能夠催化DNA分子的5'磷酸基和3'羥基之間的磷酸二酯鍵形成，從而將DNA片段連接起來，類似于生物界的“502”。除了連接DNA分子的斷裂端，T4 DNA連接酶還可以封閉單鏈RNA或DNA/RNA雜交鏈中的切口，因此在修復(fù)RNA或DNA/RNA雜交鏈的損傷時(shí)也能發(fā)揮作用。T4 DNA連接酶是一種重要的酶，在分子生物學(xué)研究和基因工程應(yīng)用中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，用于連接DNA片段、構(gòu)建重組DNA分子和修復(fù)DNA損傷等。 ? Biogradetech的T4 DNA連接酶由攜帶T4噬菌體gene 30的大腸桿菌產(chǎn)生。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA、RNA?或者DNA/RNA復(fù)合物間可修復(fù)單鏈缺刻，并且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但對于單鏈核酸無活性，主要用于限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物DNA片段克隆、基因定點(diǎn)突變與?PCR產(chǎn)物克隆、線性DNA自環(huán)化與修復(fù)雙鏈DNA缺刻。T4 DNA Ligase需要?ATP?作為輔助因子，在室溫下完成粘性末端連接反應(yīng)僅需10分鐘。 ? 艾美捷Fast T4 DNA Ligase?快速T4 DNA連接酶： 貨號?C-BSM205-1000U 名稱?Fast T4 DNA Ligase?快速T4 DNA連接酶 組分?T4 DNA Ligase(Fast) (5 U/ul)?200ul 10×T4 DNA Ligase Buffer???1ml 50% PEG?????????????????1ml ? Fast T4 DNA Ligase?快速T4 DNA連接酶使用方法： 1.DNA?插入片段連接至載體DNA（粘性末端連接） ① 于冰上配制如下反應(yīng)體系： 試劑?用量 線性化載體?DNA?20~100 ng 插入片段?DNA?3:1~10:1 (片段：載體摩爾比) 10×T4 DNA Ligase Buffer?2 ul T4 DNA Ligase?1U (0.2 ul) Nuclease-Free Water?To 20 ul ② 充分混勻并瞬離，22℃溫育10 min； ③ 取1~5 ul的連接產(chǎn)物用于50 ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2 ul用于50 ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。? ? 2.DNA插入片段連接至載體DNA（平末端連接） ① 于冰上配制如下反應(yīng)體系： 試劑?用量 線性化載體?DNA?20~100 ng 插入片段?DNA?3:1~10:1 (片段：載體摩爾比) 10×T4 DNA Ligase Buffer?2 ul 50% PEG?2 ul T4 DNA Ligase?5U (1 ul) Nuclease-Free Water?To 20 ul ② 充分混勻并瞬離，22℃溫育1 h； ③ 取1~5 ul的連接產(chǎn)物用于50 ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2 ul用于50 ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。? ? 3.線性DNA自環(huán)化 ① 于冰上配制如下反應(yīng)體系： 試劑?用量 線性化載體?DNA?10~50 ng 10×T4 DNA Ligase Buffer?5 ul T4 DNA Ligase?5U (1 ul) Nuclease-Free Water?To 50 ul ② 徹底混勻并瞬離，22℃溫育10 min； ③ 取?1~5 ul的連接產(chǎn)物用于50 ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2 ul用于50 ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。? ? 4.接頭連接 雙鏈寡核苷酸接頭經(jīng)常被用于在插入片段上產(chǎn)生粘性末端。接頭通?常包含限制酶識(shí)別位點(diǎn)，在連接后經(jīng)酶切處理產(chǎn)生和克隆載體匹配的粘端。有時(shí)候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端，此時(shí)無需在接頭連接完?成后進(jìn)行插入片段的進(jìn)一步處理。 ? 試劑?用量 線性化載體?DNA?100~500 ng 磷酸化接頭?1-2 ug 10×T4 DNA Ligase Buffer?2 ul 50% PEG?2 ul T4 DNA Ligase?2U (0.4 ul) Nuclease-Free Water?To 20 ul ② 徹底混勻并瞬離，22℃溫育10 min； ③ 在65℃作用10 min或者70℃作用5 min，進(jìn)行熱失活。??
