一、MLR混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)簡介

兩個(gè)無關(guān)個(gè)體功能正常的淋巴細(xì)胞在體外混合培養(yǎng)時(shí)，由于HLAⅡ類抗原中D和DP抗原（淋巴細(xì)胞鑒定的抗原，SD抗原）不同，可相互刺激對方的T細(xì)胞發(fā)生增殖，此為雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)；若將其中一方的淋巴細(xì)胞先用絲裂霉素C處理或射線照射使之細(xì)胞中DNA失去復(fù)制能力，但仍能刺激另一方淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，稱為單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。兩個(gè)個(gè)體間HLA抗原差異程度越大，反應(yīng)越強(qiáng)烈，可通過細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)檢查或3H-TdR摻入率檢測反應(yīng)細(xì)胞的增殖水平。如用經(jīng)照射的、已知D位點(diǎn)抗原的純合子分型細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，則可檢測待檢者的D位點(diǎn)抗原型別。若待檢者抗原與標(biāo)準(zhǔn)HLA-D抗原相同，MLC不發(fā)生增殖，此為HLA-D抗原陰性分型法。 EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞表達(dá)高水平的HLAⅡ類抗原，常作為單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中的刺激細(xì)胞。

二、實(shí)驗(yàn)所需材料及試劑

絲裂霉素C、NBS

三、實(shí)驗(yàn)步驟

分別取C57BL（H-2b）和Balb/C（H-2d）小鼠脾臟制備細(xì)胞懸液，Balb/C小鼠脾細(xì)胞懸液（2X107/ml）加絲裂霉素C（50微克/ml ）處理，37oC，30min，培養(yǎng)液洗滌3次后用5%NBS培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液（5X106/ml），作為刺激細(xì)胞，加入96孔培養(yǎng)板，5X105/0.1ml/孔； 再加入C57BL脾細(xì)胞懸液，為反應(yīng)細(xì)胞，也是5X105/0.1ml/孔；另設(shè)單獨(dú)刺激細(xì)胞孔和單獨(dú)反應(yīng)細(xì)胞孔，均為三復(fù)孔。 CO2孵葙培養(yǎng)5天，加3H-TdR 0.5 微居/孔，再培養(yǎng)12~16h后，收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，干燥后用液閃法測定cpm值， 根據(jù)以下公式計(jì)算刺激指數(shù)（SI ）：

SI＝（混合反應(yīng)細(xì)胞孔cpm－刺激細(xì)胞孔cpm值）/ 反應(yīng)細(xì)胞孔cpm值

四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、注意無菌操作。

2、刺激細(xì)胞接受照射劑量要準(zhǔn)確，使細(xì)胞暫時(shí)存活，但失去增殖的能力。

3、可用Raji或Daudi細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，也可將不同的細(xì)胞混合作為刺激細(xì)胞。

五、實(shí)驗(yàn)所需試劑清單

序號 產(chǎn)品名 ? ? ? ? ? ? ? ? 貨號 ? ? ? ? ? ? CAS 備注

1. N-溴代丁二酰亞胺(NBS)? ?JQ0005 128-08-5

2. 絲裂霉素 C ? ? ? ? ? ? ? ?HXH502136 50-07-7