從小白的角度，一刻鐘復(fù)現(xiàn)生信套路。各位小伙伴大家好，這里是美麗專欄。經(jīng)過兩期的零代碼復(fù)現(xiàn)課，相信大家一定對腫瘤領(lǐng)域的單基因套路有一定的了解，最近也有小伙伴私聊美麗，希望掌握一些非腫瘤領(lǐng)域的生信文章，作為新一代寵粉達(dá)人，這樣的需求，美麗當(dāng)然是滿足啦。接下來，美麗帶大家康康如何在非腫瘤領(lǐng)域進(jìn)行省心研究，話不多說，開始今天的復(fù)現(xiàn)之旅吧。
?

文章復(fù)現(xiàn)是生信小白成長為大神的最佳路徑。在本篇文章中，美麗將會手把手教您3圖4表逐個(gè)步驟的文章復(fù)現(xiàn)。

今天為大家?guī)硪黄?020年3月份發(fā)表于Frontiers of endocrinology（影響因子：3.644）的單基因非腫瘤生信文章套路復(fù)現(xiàn)。

話不多說，我們開始吧！

?題目?

Bioinformatic Analysis Identifies Potential Key Genes in the Pathogenesis of Turner Syndrome

材料與方法一：患者數(shù)據(jù)收集情況

作者從GEO數(shù)據(jù)庫中找到GSE46687數(shù)據(jù)集，一共包括36例樣本，其中，有 16例TS患者被證實(shí)具有母系遺傳的X染色體(45，Xm)，10例TS患者被證實(shí)具有父系遺傳的X染色體(45，Xp)，10例正常女性(46，XX)。使用測序平臺GPL570。

材料與方法二：圖表結(jié)果及復(fù)現(xiàn)

01.使用工具

1）仙桃學(xué)術(shù)工具（https://www.xiantao.love/products），

2）BioGPS數(shù)據(jù)庫（http://biogps.org/#goto=genereport&id=177）

3）Cytoscape

4）拼圖工具，AI或仙桃。

02.復(fù)現(xiàn)任務(wù)

TABLE 1?| Differentially expressed genes of Turner Syndrome

表1?尋找TS的差異基因

TABLE 2?| Tissue-specific expressed genes identified by BioGPS

表2? 利用BioGPS數(shù)據(jù)庫查找組織特異性基因

TABLE 3?| The enriched terms for DEGs

表3??DEGs富集分析

TABLE 4?| Genes of interest.

表4?最終篩選的基因

FIGURE 1?| A heatmap of 85 differentially expressed genes between monosomy X TS patients and 46,XX normal individuals.

圖1?熱圖展示差異基因

FIGURE 2?| Bar graph of 11 representative enriched functional terms.

圖2?條形圖展示11個(gè)富集功能信息

FIGURE 3?|?尋找hub genes

圖3?尋找hub基因

03.復(fù)現(xiàn)步驟

圖1?熱圖展示差異基因

首先，打開仙桃學(xué)術(shù)，點(diǎn)擊數(shù)據(jù)集檢索。

在檢索框中，輸入數(shù)據(jù)集GSE，隨后點(diǎn)擊檢索。

點(diǎn)擊選擇樣本，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，選擇前十個(gè)樣本，設(shè)置為正常組Normal。

同樣的方式，設(shè)置實(shí)驗(yàn)1組Case1。

同樣的方式，設(shè)置實(shí)驗(yàn)2組Case2。

隨后點(diǎn)擊左側(cè)的進(jìn)入我的樣本庫。

依次選擇分組1（Case），分組2（Normal）。點(diǎn)擊右側(cè)提交分析

同樣的方法，將分組1改為Case2。提交分析。

稍等片刻，出現(xiàn)分析完成字樣，可以先把分析資料下載到本地，隨后在進(jìn)行后續(xù)操作。

打開壓縮包，點(diǎn)擊分析報(bào)告

包含多個(gè)模塊，主要結(jié)果部分，可以對分析的差異基因進(jìn)行篩選。

火山圖，熱圖可以對我們分析的差異基因進(jìn)行可視化展示。

?同樣，對于圖片中的細(xì)節(jié)，可以點(diǎn)擊細(xì)節(jié)修改，進(jìn)行精細(xì)化調(diào)整，包括修改字體大小，顏色等。

同樣，在仙桃工具的高級版中，也有數(shù)據(jù)集分析模塊。

點(diǎn)擊火山圖，選中差異分析的分組，點(diǎn)擊確定。也可以獲得熱圖，并保存。

將結(jié)果命名為熱圖1。

同樣的操作步驟，將結(jié)果命名為熱圖2。

隨后，根據(jù)原文中的設(shè)置，尋找兩組的差異基因，即log>1，Padjust<0.05。

打開差異分析表格，Case1與正常樣本的比較，即為Xm-XX組：

點(diǎn)擊篩選，Padj，數(shù)字篩選

選擇小于0.05

隨后，點(diǎn)擊logFC，進(jìn)行數(shù)字篩選。

大于1或者小于-1的值

并按照logFC進(jìn)行降序排列。

取logFC大于1的gene列，另存為Xm-XX Up，

同理，取logFC小于1的gene列，另存為Xm-XX Down。

打開差異分析表格，Case2與正常樣本的比較，即為Xp-XX組：

點(diǎn)擊篩選，Padj，數(shù)字篩選

選擇小于0.05

隨后，點(diǎn)擊logFC，進(jìn)行數(shù)字篩選。

大于1或者小于-1的值

并按照logFC進(jìn)行降序排列。

取logFC大于1的gene列，另存為Xp-XX Up，

同理，取logFC小于1的gene列，另存為Xp-XX Down。

隨后，將上述四組基因，放在一個(gè)excel表格中，如下圖排序及命名。

選擇仙桃工具-基礎(chǔ)班-韋恩圖，并上傳excel文件

點(diǎn)擊確認(rèn)

保存結(jié)果。

隨后，打開拼圖工具，將上述的三張圖進(jìn)行圖片拼接。

最終圖1就拼好了。

表1?尋找TS的差異基因

閱讀原文表1，即可發(fā)現(xiàn)，作者將兩組差異分析的結(jié)果，統(tǒng)一整理到一個(gè)表格中，然后只需要分別顯示上調(diào)or下調(diào)基因，這里忍不住再提一下，作者的表格制作方式，比較創(chuàng)新，并且非常精美，值得推薦參考~

我們只需要將韋恩圖中獲取的交集差異基因，按照這個(gè)方式進(jìn)行排列即可，本部分操作步驟略。

表2?利用BioGPS數(shù)據(jù)庫查找組織特異性基因

隨后，作者利用BioGPS數(shù)據(jù)庫，尋找基因的組織特異性表達(dá)，作者使用BioGPS(http://biogps.org) 來分析DEGS的組織特異性表達(dá)。

篩選的標(biāo)準(zhǔn)為：(1)組織特異性表達(dá)水平>中位數(shù)的10倍，以及(2)第二高表達(dá)水平不到最高水平的三分之一。

具體演示步驟：打開BioGPS數(shù)據(jù)庫，分別將表1中的上調(diào)or下調(diào)基因輸入數(shù)據(jù)庫，然后查找在人體組織中，同樣出現(xiàn)特意表達(dá)的基因。我們以AGER為例。

輸入AGER點(diǎn)擊查詢。

可以看到，AGER在肺中高表達(dá)的。同樣的操作，將其他基因輸入，最終鑒定了23個(gè)在特定組織或器官系統(tǒng)中表達(dá)的基因。并整理成表2.

圖2?條形圖展示11個(gè)富集功能信息

這里，作者用Excel進(jìn)行富集分析，我們可以將基因輸入仙桃工具，獲取GO富集分析圖。

選擇仙桃工具-功能聚類-GO|KEGG富集分析，在分子列表中輸入基因名稱，點(diǎn)擊確認(rèn)。

點(diǎn)擊保存結(jié)果，在結(jié)果中顯示獲得的基因，隨后可以選擇GO|KEGG可視化模塊。

溫馨提示：這里面，美麗選擇其中一組up交集進(jìn)行的通路富集，與作者的分析略有出入，小伙伴學(xué)會分析方法即可，不需要太較真為何有的時(shí)候復(fù)現(xiàn)與原文不一致。我們學(xué)習(xí)復(fù)現(xiàn)，只是為了學(xué)會分析思路，并不需要百分之百復(fù)現(xiàn)作者原圖，畢竟是作者已經(jīng)發(fā)表的文章，哪怕我們原文完整復(fù)現(xiàn)，也不能拿來投稿喲。

表3?DEGs富集分析

根據(jù)上述GO、KEGG分析，作者最終選擇以下通路進(jìn)行展示。

我們可以直接將上面保存在仙桃工具中的GO|KEGG富集分析表下載，作為結(jié)果的展示。

當(dāng)然，也可以進(jìn)一步按照作者展示的模式，進(jìn)行修改。

圖3?尋找hub基因

將表1中的基因上傳到仙桃工具-交互網(wǎng)絡(luò)-PPI蛋白互作分析。復(fù)制基因至分子列表，基本參數(shù)：互作分?jǐn)?shù)默認(rèn)0.4中可信度，與文中描述一致。點(diǎn)擊確認(rèn)，獲取結(jié)果。

將基因?qū)?yīng)的上調(diào)or下調(diào)屬性列為一個(gè)屬性列表。

打開cytoscape軟件，將上述兩個(gè)文件分別導(dǎo)入。

導(dǎo)入互作關(guān)系列表。

點(diǎn)擊OK。

隨后，導(dǎo)入屬性關(guān)系列表。

修改展示風(fēng)格，按照屬性（attribute）進(jìn)行展示，上調(diào)為紅色，下調(diào)為綠色。保存為圖A。

選擇MCODE模式

獲得兩組展示模式。分別點(diǎn)擊每種模式下的基因，保存為圖B,圖C。

在AI或者仙桃工具中完成拼圖工作。最終獲得圖2如下。

表4?最終篩選的基因

根據(jù)上面MCODE獲取的Hub Gene，作者最終選擇上述6個(gè)上調(diào)基因，10個(gè)下調(diào)基因作為最終納入的Hub gene。

好了，以上是復(fù)現(xiàn)步驟。

全文總結(jié)

?最后一個(gè)模塊：根據(jù)本文的圖表進(jìn)行邏輯梳理?

挑TABLE 1 | Differentially expressed genes of Turner Syndrome（表1，尋找TS的差異基因）

挑&靠TABLE 2 | Tissue-specific expressed genes identified by BioGPS( 表2利用BioGPS數(shù)據(jù)庫查找組織特異性基因)

聯(lián)TABLE 3 | The enriched terms for DEGs(表3DEGs富集分析)

挑TABLE 4 | Genes of interest.（表4 最終篩選的基因）

挑FIGURE 1 | A heatmap of 85 differentially expressed genes between monosomy X TS patients and 46,XX normal individuals.（圖1 熱圖展示差異基因）

圈FIGURE 2 | Bar graph of 11 representative enriched functional terms.（圖2 條形圖展示11個(gè)富集功能信息）

聯(lián)FIGURE 3尋找hub genes（圖3 尋找hub基因）

作者利用GEO數(shù)據(jù)庫，特別是特納綜合征的數(shù)據(jù)集，包含表達(dá)譜數(shù)據(jù)，雖然沒有臨床信息，但是作者巧妙的用了一個(gè)BiosGPS數(shù)據(jù)庫，用人體組織代替臨床信息，非常討巧的思路，值得借鑒。隨后，進(jìn)行多輪Hub gene的篩選，將挑圈聯(lián)靠應(yīng)用到極致，并最終獲得與特納綜合征相關(guān)的上下調(diào)分子。

本文的另一個(gè)亮點(diǎn)是對于數(shù)據(jù)信息的整理，條例邏輯非常清晰，雖然也是湊圖，但是湊得特別有逼格，非常值得借鑒。

可以說，雖然本文是非腫瘤生信文章，但是研究套路，總體上離不開挑圈聯(lián)靠四字真言。那么，非腫瘤分析的重中之重，在于數(shù)據(jù)的獲取。我們都知道，TCGA數(shù)據(jù)庫，只包含33種腫瘤信息，那么，對于非腫瘤的部分，需要從GEO或者專門的疾病數(shù)據(jù)庫種獲取，至于如何利用GEO數(shù)據(jù)庫分析？一般有R語言，以及GEO2R在線網(wǎng)站兩種方式，如今，有了仙桃工具，可以跨越科學(xué)上網(wǎng)的屏障，非常便利的獲取分析結(jié)果。雖然目前只上線GPL570一個(gè)平臺的數(shù)據(jù)，但是這個(gè)平臺是目前測序數(shù)據(jù)量最大，應(yīng)用最廣泛的平臺，完全滿足我們?nèi)粘Ｍ诰蚍治觯送?，技術(shù)小哥哥還在加班加點(diǎn)進(jìn)行其他平臺的數(shù)據(jù)清洗，相信不久后，更多的GEO數(shù)據(jù)集可以在仙桃工具上進(jìn)行點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)式的分析。小伙伴們可以期待一下哦。

回顧一下，本文的復(fù)現(xiàn)，只需要依靠一個(gè)仙桃工具，聯(lián)合一個(gè)互作軟件，就能完美收官，這一波操作，是不是很贊。

文末彩蛋

此外，文末彩蛋，給大家列一下單基因的分析流程

??怎么樣，經(jīng)過一系列的復(fù)現(xiàn)，是否現(xiàn)在摩拳擦掌，迫不及待的想要開始學(xué)習(xí)起來了，期待大家的復(fù)現(xiàn)之旅，也希望大家可以把自己在復(fù)現(xiàn)過程中遇到的問題發(fā)出來，我們可以在討論區(qū)互動(dòng)哦~