小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的先天免疫細胞，其通過支持神經元成熟和完善突觸連接積極參與大腦發(fā)育。這些細胞具有高度代謝靈活性，能夠氧化不同的底物以滿足其能量需求。乳酸在大腦中特別豐富，但小膠質細胞是否可將其用作代謝燃料尚不清楚。

2023年9月16日，發(fā)表在《Nature Communications》雜志上的一篇題為“Loss of microglial MCT4 leads to defective synaptic pruning and anxiety-like behavior in mice”的文章，揭示了乳酸輸入調節(jié)小膠質細胞功能的機制。

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首先，為了評估代謝靈活性的轉錄基礎，作者分析了從成年 Cx3cr1GFP 小鼠大腦中分離出的小膠質細胞的表達譜（數據集來自 Pinto 等人，ArrayExpress 數據庫 E-MEXP-3347）與細胞內主要 KEGG 代謝途徑的關系。作者發(fā)現(xiàn)每個代謝途徑中的大多數基因在小膠質細胞中高度表達。通過小膠質細胞中的模型分數與從成年小鼠海馬體中敏銳分離的其他腦細胞群（神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞）相比，分析了 KEGG 通路基因的表達。結果發(fā)現(xiàn)與其他細胞類型相比，小膠質細胞在氧化磷酸化和糖酵解方面表現(xiàn)出相對較高的得分。這表明了小膠質細胞具有代謝多種能量底物的內在能力。LDHB是參與小膠質細胞代謝調節(jié)的最豐富的基因之一。在成年小鼠海馬區(qū)的所有其他腦細胞類型中， LDHB在小膠質細胞中高度富集，并且其在這些細胞中的表達高峰在出生后第二周，這是突觸高度重塑的時期。由于含有 LDHB 的同工型在優(yōu)先將乳酸轉化為丙酮酸的細胞中富集，作者推測其在小膠質細胞中的高水平可能是乳酸代謝的重要作用的基礎。作者探究了小膠質細胞是否可以輸入外源性乳酸。利用代謝物的熒光類似物 (SCOTflors) 并使用熒光乳酸通過實時共焦成像評估原代小膠質細胞中的乳酸輸入情況。孵育一小時后，在小膠質細胞內部即可檢測到熒光 SCOTflu 乳酸，并且當培養(yǎng)基中的葡萄糖可用性降低時，熒光 SCOTflu 乳酸顯著升高（25 mM 與 0.1 mM 葡萄糖）。此外，通過質譜法證實，與對照組相比，暴露于 20 mM 乳酸鈉的原代小膠質細胞的乳酸水平增加了約四倍，表明這些細胞中乳酸的顯著輸入。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明了小膠質細胞能夠內化細胞外乳酸。

圖1. 小膠質細胞代謝靈活，可在體外有效輸入乳酸

乳酸可以通過一類質子連接的溶質載體成員 (SLC16) 跨細胞膜轉運，這些成員攜帶具有一個羧酸鹽基團（單羧酸鹽）的分子，例如乳酸鹽、丙酮酸鹽和酮，因此定義為單羧酸鹽轉運蛋白 (MCT)。在組成 MCT 家族的 14 種亞型中，大腦中高度豐富的乳酸轉運蛋白是 MCT1、MCT2 和 MCT4，它們也由小膠質細胞表達。因此，作者思考它們中是否負責這些細胞中乳酸運輸。暴露于 25 mM 乳酸鈉 24 小時后，觀察到僅編碼 MCT4 的 Slc16a3 轉錄本顯著上調。在原代小膠質細胞中，而 MCT1 或 MCT2 沒有變化。乳酸暴露也顯著增加了MCT4的蛋白質水平。這些發(fā)現(xiàn)支持了 MCT4 在小膠質細胞對細胞外乳酸反應中的直接影響。接下來，為了進一步闡明 MCT4 所發(fā)揮的下游調控作用，通過 Cx3cr1 CREert2和 Slc16a3 flox小鼠雜交，產生了可誘導的小膠質細胞特異性條件性 MCT4 敲除小鼠系，以產生 Cx3cr1 CREert2/+；Slc16a3 flox/flox (MCT4 cKO)和Cx3cr1 CREert2/+；Slc16a3 +/+（對照）同窩小鼠。這些小鼠用于制備原代小膠質細胞培養(yǎng)物，并通過 4-羥基他莫昔芬治療在體外誘導 MCT4 敲除細胞系。蛋白質印跡實驗證實了 MCT4 敲除的效率，與對照相比，減少了 90% 以上。為了進一步測試乳酸是否直接參與溶酶體酸化，將原代小膠質細胞暴露于 25 mM 乳酸中 24 小時。在沒有 MCT4 的情況下，施用乳酸完全無法誘導任何改變。暴露于相似濃度丙酮酸鹽的原代小膠質細胞沒有顯示出LysoTracker覆蓋區(qū)域的任何改變，證實了觀察到的對溶酶體酸化的影響是由乳酸而不是其他單羧酸鹽特異性誘導的。富含 LDHB 的同工酶引起的乳酸分解代謝被認為可以通過 v-ATP 酶（溶酶體的質子泵）促進溶酶體酸化。V-ATP酶抑制劑巴弗洛霉素A1完全阻止小膠質細胞中乳酸暴露誘導的LysoTracker信號增加，表明乳酸誘導的溶酶體酸化調節(jié)取決于V-ATP酶活性?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明細胞外乳酸導致小膠質細胞中晚期內體和溶酶體的酸化增強，并且這嚴格依賴于 MCT4 轉運蛋白。缺乏 MCT4 的小膠質細胞表現(xiàn)出乳酸誘導的降解細胞器酸化缺陷，表明它們的吞噬功能可能受到損害。

圖2. 小膠質細胞中的乳酸轉運體 MCT4 在細胞外乳酸的作用下上調，并且是乳酸依賴性溶酶體酸化所必需的

接下來，作者探究了小膠質細胞 MCT4 缺失是否會導致小膠質細胞吞噬能力功能障礙。為此，在對照和敲除細胞中進行了 DQ-BSA 測定。DQ-BSA 是蛋白酶的熒光底物，其熒光通過 BODIPY 染料標記而猝滅。DQ-BSA 被蛋白酶水解為單肽后，猝滅現(xiàn)象得到緩解，因此熒光信號可以作為蛋白水解活性的代表。與對照相比，信號定量顯示敲除MCT4的小膠質細胞產生的熒光顯著減少，表明降解能力有缺陷。吞噬細胞活性在促進突觸元件的吞噬和隨后的有效降解中發(fā)揮著重要作用，特別是在出生后早期的大腦中，此時小膠質細胞通過消除多余的突觸連接對塑造神經回路發(fā)揮著重要作用。為了研究觀察到的降解受損是否也與突觸結構相關，將小膠質細胞暴露于從 CamKIIa CRE ;Rosa26-fl-STOP-fl-TdTomato 小鼠中分離的熒光標記突觸體，并對其吞噬（T0 時：孵育 1 小時后）和降解（T6 時：T0 沖洗 6 小時后）進行量化。共聚焦采集和成像分析顯示，MCT4 KO細胞對突觸體的吞噬減少，并且降解能力顯著受損，這與它們的溶酶體酸化缺陷一致。作者又研究了體內對乳酸的功能反應是否也可能發(fā)生改變，從而影響 MCT4 敲除小鼠中小膠質細胞介導的突觸重塑。為了解決小膠質細胞乳酸轉運在海馬發(fā)育中的作用，通過在 Cx3cr1 CREert2/+ ;Slc16a3 flox/flox和 Cx3cr1 CREert2/+ ;Slc16a3 +/+雄性和雌性同窩小鼠的 P6 和 P8 處注射他莫昔芬，選擇性地耗盡小膠質細胞中的 MCT4，在 P15 時收集大腦組織用于下游分析。在轉錄本和蛋白質水平上證實了在分離的小膠質細胞中MCT4的有效敲除。接下來，研究了MCT4 的缺失是否會影響小膠質細胞的形態(tài)。來自對照和敲除MCT4基因的同窩小鼠的海馬細胞的三維重建沒有顯示出主要的結構改變，因為來自兩種基因型的雄性和雌性受試者的小膠質細胞顯示出相似的Iba1+體積和表面積。雖然 CD68+ 結構的數量也沒有受到影響，但觀察到它們的平均體積顯著增加。CD68 是小膠質細胞和巨噬細胞中吞噬溶酶體的標記物，然而，它的存在不能直接作為吞噬細胞活性的代表。事實上，CD68+結構體積的增加可能表明吞噬增強，或者相反，它可能表明由于降解缺陷導致吞噬溶酶體過度積累。根據之前的觀察，作者預測MCT4基因敲除的小膠質細胞中吞噬溶酶體大小的增加可能反映了攝入物質（可能包括突觸物質）的清除功能障礙。

圖3. MCT4 基因敲除的小膠質細胞在體外表現(xiàn)出吞噬功能減弱和溶酶體功能障礙，在體內則表現(xiàn)出吞噬溶酶體結構的改變

隨后，作者對 P15 小鼠的海馬勻漿進行了蛋白質印跡實驗，以篩選不同的突觸前和突觸后標記，并發(fā)現(xiàn)其中許多標記（突觸蛋白、VGAT、GluA2）在敲除小鼠中比對照同窩小鼠顯著更豐富。海馬切片的免疫染色進一步證實了突觸蛋白的顯著增加。對突觸前和突觸后標記物 synapsin 和 homer1 之間的共定位點進行定量，顯示突觸數量顯著增加，支持了 MCT4 的小膠質細胞丟失引起的結構變化。高爾基-考克斯分析表明敲除小鼠和對照同窩小鼠之間的樹突棘密度沒有變化，與突觸后支架蛋白homer1和PSD95水平沒有變化一致?？偟膩碚f，這些數據表明小膠質細胞中 MCT4 的選擇性丟失不僅會導致內在的小膠質細胞功能障礙，而且足以在突觸水平上引起后果。為了進一步研究突觸標記物的增加是否與體內小膠質細胞修剪缺陷直接相關，作者評估了對照小鼠和敲除小鼠 CA1 海馬區(qū)小膠質細胞對突觸蛋白的吞噬情況。結果發(fā)現(xiàn)敲除小鼠中被吞噬的突觸斑點數量顯著升高。此外，CD68+吞噬溶酶體結構內突觸蛋白總體積的定量顯示在敲除細胞中顯著增加，這與體外觀察到的攝入物質的缺陷降解和隨后的積累結果一致。這些數據表明了小膠質細胞 MCT4 在介導產后早期海馬突觸消除中的關鍵作用。

圖4. 小膠質細胞中MCT4的缺失導致海馬突觸修剪的改變

之后，作者研究了 MCT4基因敲除小鼠中有缺陷的突觸重塑是否對海馬神經元的神經傳遞有功能性影響。制備了幼年小鼠（P15 和 P30）的腦切片，并對 CA1 錐體細胞進行膜片鉗實驗。與對照組相比，敲除小鼠記錄的自發(fā)興奮性突觸后電流（sEPSC）的幅度顯著更高，sEPSC 頻率的趨勢相似。這些結果表明 CA1 錐體神經元有更大的突觸興奮，這種現(xiàn)象與在突觸蛋白（包括突觸蛋白和 GluA2）水平上觀察到的變化一致。此外，電刺激 P15 小鼠海馬切片中的 Schaffer 側枝后記錄 AMPA 和 GABA 介導的電流，顯示與對照組相比，敲除小鼠錐體神經元中的 AMPA/GABA 比率增加。值得注意的是，小膠質細胞功能障礙和對 CA1 錐體細胞的較高突觸興奮先前已被認為與癲癇發(fā)作的脆弱性有關。因此，作者推測MCT4基因敲除小鼠更容易受到致癇藥物的影響。為此，給予單一亞閾劑量的紅藻氨酸 (KA)，這是一種有效的神經興奮化合物，用于通過模擬谷氨酸能神經傳遞來研究海馬依賴性癲癇發(fā)作的機制。正如預期的那樣，腹膜內給予 2 mg/kg KA 并沒有在對照小鼠中引起任何癲癇相關反應。然而，敲除的雄性和雌性小鼠早在注射后一小時就出現(xiàn)陣攣性癲癇發(fā)作。這些數據證實了小膠質細胞 MCT4 的缺失會導致幼年小鼠海馬突觸結構和功能的改變。三羧酸（TCA）循環(huán)分析顯示中間代謝物琥珀酸顯著增加，與其積累在促進癲癇發(fā)作中的作用一致。敲除小鼠的海馬呈現(xiàn)出多種?；鈮A中間體水平增加，例如羥基丁酰肉堿、己酰基-L-肉堿、L-辛酰基肉堿和十六烯?；?肉堿。?；鈮A (AC) 由肉堿和?；o酶 A 通過線粒體或過氧化物酶體中的肉堿?；D移酶形成。由于脂肪酸、葡萄糖和氨基酸的代謝可以產生 AC，因此在敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)的高水平 AC 可能表明在小膠質細胞 MCT4 缺失的情況下存在代謝適應。

圖5. 小膠質細胞 MCT4 的缺失會導致海馬突觸功能改變和代謝變化

最后，為了研究小膠質細胞中MCT4的出生后早期消耗是否會導致成年期的行為改變，作者進行了幾項旨在表征小鼠行為的測試。首先在露天場地對小鼠進行測試，以評估基本的運動活動以及焦慮樣行為。雖然性別和基因型之間的運動和不動時間相當，但與對照同窩仔鼠相比，成年敲除雄性花在探索競技場中心的時間顯著減少，并且在中心移動的距離也縮短，這表明焦慮增加。這在高架十字迷宮（EPM）測試中得到證實，其中敲除MCT4基因的雄性在閉合臂中花費顯著更多的時間，并且它們也表現(xiàn)出不動時間的增加。雖然焦慮表型是性別依賴性的，并且僅存在于男性中，但女性表現(xiàn)出不同的異常行為，EPM 中的探索和平均速度顯著降低。此外，也分析了自我梳理行為，包括對新環(huán)境的反應和對物理刺激（即在鼻子上噴水）的反應。雖然與對照組相比，敲除MCT4的雄性小鼠在兩種類型的梳理行為中表現(xiàn)出相似的水平，并且在噴水時有所增加，但敲除MCT4的雌性在噴霧誘導的梳理行為中表現(xiàn)出顯著減少，表明空間記憶和運動協(xié)調不受小膠質細胞 MCT4 丟失的影響。

圖6. 成年MCT4基因敲除小鼠表現(xiàn)出類似焦慮的行為

總之，本研究結果表明小膠質細胞可以輸入乳酸，這與溶酶體酸化的增加相一致。在體外，小膠質細胞中單羧酸轉運蛋白 MCT4 的缺失會阻止乳酸誘導的溶酶體調節(jié)，并導致貨物降解缺陷。體內 MCT4 的小膠質細胞耗竭會導致突觸修剪受損，與海馬神經元興奮增加、AMPA/GABA 比率增加、容易出現(xiàn)癲癇發(fā)作和焦慮樣表型?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明了選擇性破壞小膠質細胞中的 MCT4 轉運蛋白足以改變突觸細化并誘導小鼠大腦發(fā)育和成年行為缺陷。