1.葉綠素含量的測(cè)定

試劑：95%乙醇（C2H5OH）、石英砂、碳酸鈣粉、

實(shí)驗(yàn)步驟:

? ? 稱取剪碎的新鮮樣品 0.2～0.3g，加乙醇10ml，提取直至無綠色為止。把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，以95%乙醇為空白，在波長(zhǎng)663nm和645nm下測(cè)定吸光度。

計(jì)算公式:? ? ? ? ?Ca=12.7 A663—2.59 A645?

? ? ? ? ? ? ? ? ? Cb=22.9 A645—4.67 A663?

? ? ? ? ? ? ? ? ? Ca十b＝20.3 A645—8.04 A663

2.過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定

試劑:

0.05 mol/L PH 7.0的磷酸緩沖液：0.2M A液（Na2HPO4）61ml和0.2M B液（NaH2PO4）39ml混100ml，用去離子水定容400ml 。

儲(chǔ)備液A：0.2M Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4*7H2O或71.7g Na2HPO4*12H2O配成1000ml）?

儲(chǔ)備液B：0.2M NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4*H2O配成1000ml）

愈創(chuàng)木酚、30％H2O2

反應(yīng)混合液:50ml的0.05mol/L（PH0.7）L磷酸緩沖液中加入28ul的愈創(chuàng)木酚，加熱攪拌直至愈創(chuàng)木酚溶解，再加入19ul的30％H202混合。

實(shí)驗(yàn)步驟:

（1）酶液提?。呵逑锤蓛羧~片擦干，稱取0.2～0.3 g葉片，剪成小片，放入研缽加入石英砂、及2ml 50mmol的PH 7.0(5.5-7.5)的磷酸緩沖液PBS（0.02-0.1mmol）進(jìn)行研磨，磨碎后在加入8mlPBS溶液洗滌研缽一并裝入離心管內(nèi)，4℃下4000rmin-1離心15min，收集上清液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）顯色反應(yīng)

過氧化物酶活性（△OD470/(min.g)） =（△A470×VT）/（W×VS×0.01×t）

式中：△A470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，W為葉片鮮重g，t為反應(yīng)時(shí)間min，Vt為提取酶液總體積ml，Vs為測(cè)定時(shí)取用的酶液體積ml。

3.植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定

試劑:

（1）2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中（原液稀釋2.3倍），攪拌加熱（70℃）溶解，貯于4℃冰箱中，2-3日有效。?

（2）3％磺基水楊酸配配制：3.496g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。（3）10μg·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液配制：精確稱取20mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度（為100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取該溶液10ml， 加蒸餾水稀釋定容至100ml，即為10μg·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。

脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:

（1）取6支試管，編號(hào)，按下表配制每管含量為0～12μg的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。加入表中試劑后，置于沸水浴中加熱30min。取出冷卻。以去離子水溶液為空白對(duì)照，在520mm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ? ? ?以1～5號(hào)管脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測(cè)定:

（1）脯氨酸的提取? ? ? ?

稱取0.2～0.3g葉片于20ml試管 + 10ml 3％磺基水楊酸溶液→沸水浴10min（提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)）→冷卻過濾于干凈的試管中→脯氨酸提取液。（2）測(cè)定 ? ? ? 吸取酶提取液2ml + 2ml H2O + 2ml冰醋酸 + 4ml 2.5﹪酸性茚三酮→沸水浴30min→溶液呈紅色→冷卻→取上層液于比色杯520mm處測(cè)定吸光度（A）值。

計(jì)算結(jié)果? ? ?

? ?從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測(cè)定液中脯氨酸的含量，按下公式計(jì)算樣品中脯氨酸含量：

脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝ X×提取液總量（ml）/樣品鮮重（g）× 測(cè)定時(shí)提取液用量（ml）

?公式中：X －從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量（μg）

4.植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

試劑:

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（100 μg/mL 牛血清白蛋白）：稱取牛血清蛋白25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液40 mL ，用蒸餾水稀釋至100 mL 即可。

考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取 100 mg 考馬斯亮藍(lán) G-250 ，溶于 50 mL 90 ％乙醇中，加入 100 mL 85％（ W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到 1000 mL ，貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)步驟:

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? ? ? ??

? ? 取 6 支試管，按下表 加入試劑，搖勻，向各管中加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，并放置 5 min 左右，以 0 號(hào)試管為空白對(duì)照，在 595 nm 下比色測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定 :

（1） 樣品提取 稱取鮮樣 0.25 ～ 0.5 g ，用 5 mL 蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后， 3000 r/min 離心 10 min ，上清液備用。（2）吸取樣品提取液 0.3 mL （視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋），放入試管中（每個(gè)樣品重復(fù) 2 次），加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑搖勻，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，測(cè)定吸光度，并通過

標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。

樣品中蛋白質(zhì)的含量=（C*V1）/（V2*W*1000） ?（mg/g）

式中:

C-查標(biāo)準(zhǔn)曲線得ug

V1-提取液總體積 ml

V2-測(cè)定時(shí)加樣量 ml

W-樣品鮮重 ?g

5.根活力的測(cè)定

?試劑 :

1. 乙酸乙酯（分析純）。?

2. 次硫酸鈉（ Na 2 S 2 O 4 ，分析純），粉末。?

3. 1 ％ TTC 溶液：準(zhǔn)確稱取 TTC 1.0 g ，溶于少量水中，定容到 100 mL 。用時(shí)稀釋至需要的濃度。?

4. 磷酸緩沖液（ 1/15 mol/L ， pH7.0 ）。?

5. 1 mol/L 硫酸：用量筒取比重 1.84 的濃硫酸 55 mL ，邊攪拌邊加入盛有 500 mL 蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至 1000 mL 。?

6. 0.4 mol/L 琥珀酸：稱取琥珀酸 4.72 g ，溶于水中，定容至 100 mL 即成。?

儀器設(shè)備?

小燒杯 3 個(gè)，研缽 1 個(gè)，移液管： 0.5 mL 1 支、 10 mL 1 支、 5 mL 3 支，刻度試管 6 支，分光光度計(jì)，分析天平（感量 0.1 mg ），電子頂載天平（感量 0.1 g ），溫箱，試管架，藥勺，石英砂適量，濾紙。?

實(shí)驗(yàn)步驟：?

1. 定性測(cè)定?

（ 1 ）配制反應(yīng)液 把 1 ％ TTC 溶液、 0.4 mol ／ L 的琥珀酸和磷酸緩沖液按 1:5:4 比例混合。?

（ 2 ）把根仔細(xì)洗凈，把地上部分從莖基部切除。將根放入三角瓶中，倒入反應(yīng)液，以浸沒根為度，置 37 ℃左右暗處放 1 ～ 3 h ，以觀察著色情況，新根尖端幾毫米以及細(xì)側(cè)根都明顯地變成紅色，表明該處有脫氫酶存在。?

2. 定量測(cè)定?

（ 1 ） TTC 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取 0.4 ％ TTC 溶液 0.2 mL 放入大試管中，加 9.8 mL 乙酸乙酯，再加少許 Na 2 S 2 O 4 粉末搖勻，則立即產(chǎn)生紅色的 TTF 。此溶液濃度為每毫升含有 TTF 80 μg 。分別取此溶液 0.25 mL 、 0.50 mL 、 1.00 mL 、 1.50 mL 、 2.00 mL 置 10 mL 刻度試管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含 TTF 20 μg 、 40 μg 、 80 μg 、 120 μg 、 160 μg 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以乙酸乙酯作參比，在 485 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。?

（ 2 ）稱取根尖樣品 0.5 g ，放入小燒杯中，加入 0.4 ％ TTC 溶液和磷酸緩沖液（ pH7.0 ）各 5 mL ，使根充分浸沒在溶液內(nèi)，在 37 ℃下暗保溫 1 ～ 2 h ，此后立即加入 1 mol/L 硫酸 2 mL ，以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品， 37 ℃下暗保溫后不加硫酸，其溶液濃度、操作步驟同上）。?

（ 3 ）把根取出，用濾紙吸干水分，放入研缽中，加乙酸乙酯 3 ～ 4 mL ，充分研磨，以提出 TTF 。把紅色提取液移入刻度試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈?2 ～ 3 次，皆移入刻度試管，最后加乙酸乙酯使總量為 10 mL ，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 485 nm 下比色，以空白試驗(yàn)作參比測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出 TTC 還原量。

結(jié)果計(jì)算:

根系活力= C/(1000*W*h) [mg TTF/（g?h）]

式中：C——四氮唑還原量,μg.

W——根重,g.

h——時(shí)間,h.

6.根中過氧化氫酶的測(cè)定

試劑:PH7.0磷酸緩沖液

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）酶液提取 ?取葉片0.2～0.3g加入2ml pH7.0的磷酸緩沖液少量研磨成勻漿，在加緩沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離心管中，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）測(cè)定：取10ml試管2支，其中1號(hào)為樣品測(cè)定管，1號(hào)為空白管，按下表順序加入試劑。25℃預(yù)熱后，逐管加入0.5ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后，按下式計(jì)算酶活性。

（3）結(jié)果計(jì)算：以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。

? ? ? 過氧化氫酶活性(u/gFW/min)= A240x′VT/（0.1′V1′t′FW）

式中DDA240=Aso-（As1+As2）/2

AS0—加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值； ? ? AS1， AS2—樣品管吸光值； ? ? ? ? ? ? ? ? ? Vt—粗酶提取液總體積（ml）； ? ? V1—測(cè)定用粗酶液體積（ml）； ? ? ? ? ? ? ? FW—樣品鮮重（g）； ? ? 0.1—A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位（u）； ? ?t—加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間（min）。