隨著現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)的進(jìn)步，序列分析已成為蛋白質(zhì)、多肽、抗體、疫苗類生物藥物分子以及膠原蛋白等醫(yī)療器械類產(chǎn)品的研發(fā)和質(zhì)量控制中的重要環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)的全序列驗(yàn)證分析扮演關(guān)鍵角色，能夠確認(rèn)重組蛋白質(zhì)多肽類生物制品的完整準(zhǔn)確表達(dá)，確保產(chǎn)品質(zhì)量和有效性。

百泰派克生物科技BTP基于CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量認(rèn)證體系，建立蛋白測(cè)序平臺(tái)，該平臺(tái)配備多臺(tái)N端序列分析儀、超高效液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用、經(jīng)過(guò)多輪優(yōu)化的蛋白從頭測(cè)序算法平臺(tái)。結(jié)合先進(jìn)的分析設(shè)備和算法，BTP能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行全序列驗(yàn)證分析，確保蛋白質(zhì)的完整性和準(zhǔn)確性，以滿足您的研究和質(zhì)量控制需求。

液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）蛋白全序列驗(yàn)證分析:

蛋白全序列驗(yàn)證分析的一般流程是使用特異性蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行酶解切割，酶解后的供試品是復(fù)雜的肽段組成的混合物，然后通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)對(duì)供試品進(jìn)行質(zhì)譜分析。

首先，是對(duì)樣本進(jìn)行前處理，即根據(jù)蛋白全長(zhǎng)理論氨基酸序列結(jié)合質(zhì)譜級(jí)別蛋白酶酶切位點(diǎn)信息選擇至少五種蛋白酶對(duì)蛋白進(jìn)行酶切，提高酶切效率，以便獲得更高的覆蓋度。實(shí)際實(shí)驗(yàn)中可以從多種蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Asp-N、Glu-C、Lys-C和Lys-N等）中選擇合適的蛋白酶或者組合酶切的方式對(duì)靶蛋白進(jìn)行酶切；其次，使用液質(zhì)聯(lián)用Nano-LC-MS/MS 平臺(tái)對(duì)酶切之后的肽段混合物進(jìn)行分析，得到總離子流色譜圖和質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)；然后，以所測(cè)定蛋白的理論序列建立本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)專業(yè)分析軟件匹配并計(jì)算每一種酶切之后鑒定到的肽段；利用酶切位點(diǎn)之間的互補(bǔ)性對(duì)蛋白序列進(jìn)行拼接，最終實(shí)現(xiàn)蛋白全序列驗(yàn)證。

案例示意圖:

抗體輕鏈全序列驗(yàn)證分析示意圖

一般流程：

1、使用多種蛋白酶組合酶切的方式對(duì)蛋白進(jìn)行酶切，提高酶切效率，以便獲得蛋白每一個(gè)氨基酸的序列信息。

2、使用 Nano-LC-MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用高分辨平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行分析。

3、將得到的質(zhì)核比信息與理論序列建立的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

4、拼接每種酶切方式鑒定到的肽段，得到蛋白是否完整正確表達(dá)的信息。

實(shí)驗(yàn)儀器:

液相色譜儀（Easy-nLC1200）|電噴霧-組合型四級(jí)桿-Orbitrap 質(zhì)譜儀（Q Exactive? HybridQuadrupole-Orbitrap? Mass Spectrometer ）

應(yīng)用:

蛋白質(zhì)、多肽、抗體、疫苗、膠原蛋白等生物制品的氨基酸全序列驗(yàn)證分析|蛋白質(zhì)翻譯后修飾和化學(xué)修飾分析|蛋白質(zhì)、多肽、抗體、疫苗、膠原蛋白等生物制品的氨基酸序列突變分析

常見(jiàn)問(wèn)題:

問(wèn)題1：覆蓋度能反映什么問(wèn)題呢？若覆蓋度不足100%該怎么處理？?

回答：覆蓋度是指被測(cè)序到的序列占全序列大小的比率。反應(yīng)了我們的測(cè)序結(jié)果對(duì)于我們蛋白的覆蓋情況，若覆蓋率為100%代表樣品經(jīng)酶解處理之后得到的序列與目標(biāo)序列高度吻合，若覆蓋率不足100%，我們會(huì)審查蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)和序列，查看缺失多少序列以及哪些理論上的肽段未檢測(cè)到；根據(jù)實(shí)際結(jié)果判斷是否繼續(xù)使用現(xiàn)有方法和酶解處理，重新獲得肽遺失的位置，還是蛋白樣品本身發(fā)生了突變，需要進(jìn)行從頭測(cè)序分析。?

問(wèn)題2：想要進(jìn)行測(cè)序的蛋白質(zhì)分子量較小，如何進(jìn)行蛋白樣品制備？?

回答：如果蛋白分子量比較小，可以使用濃度較高的SDS-PAGE膠將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后對(duì)蛋白膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，再將與目的蛋白大小一致的蛋白條帶切割下來(lái)，切下來(lái)的蛋白膠條用于質(zhì)譜鑒定。?