? ? ? ? ? 今天介紹的是丁肝病毒(Hepatitis Deltavirus/HDV/DV)。

簡介

? ? ?? 丁肝病毒(HDV)是五種已知的肝炎病毒[甲肝病毒(正義RNA病毒，肝病毒/Hepatovirus)、乙肝病毒(擬逆轉(zhuǎn)錄病毒，肝炎DNA病毒/Hepadnavirus)、丙肝病毒(正義RNA病毒，丙肝病毒/Hepacivirus)、丁肝病毒(類病毒/反義RNA病毒，丁肝病毒/Deltavirus)和戊肝病毒(正義RNA病毒，戊肝病毒/Hepevirus)]中最小的病毒，也是唯一感染人類的類病毒。它被認(rèn)為是衛(wèi)星病毒，因?yàn)樗荒茉诖嬖贖BV感染的情況下傳播。HDV的傳播既可以通過同時(shí)感染HBV（合并感染）發(fā)生，也可以疊加在慢性HBV或HBV攜帶者狀態(tài)（超感染）上。 與單獨(dú)感染HBV相比，HDV的雙重感染和合并感染均導(dǎo)致更嚴(yán)重的并發(fā)癥。這些并發(fā)癥包括在急性感染中發(fā)生肝衰竭的可能性更大，并迅速發(fā)展為肝硬化，

在慢性感染中罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。HBV-HDV混合感染在所有肝炎感染中的死亡率最高，為20％。

病毒結(jié)構(gòu)與基因組

? ? ? ?丁肝病毒是一種直徑為36nm的小型球形病毒。它的外層含有三種HBV包膜蛋白：大、中、小HBV表面抗原，以及圍繞內(nèi)部核衣殼的宿主脂質(zhì)。核衣殼包含每個(gè)基因組1682個(gè)核苷酸(丁肝病毒1型/HDV-1/DV-A/Hepatitis D virus A/Hepatitis Deltavirus A/Deltavirus A)的單鏈環(huán)狀RNA和約200個(gè)分子的D型肝炎抗原（HDAg，又名德爾塔抗原）。HDAg的中央?yún)^(qū)域已顯示與RNA結(jié)合。HDAg的N末端的卷曲螺旋區(qū)域也介導(dǎo)了幾種相互作用。由于丁肝病毒的環(huán)狀基因組具有較高的GC核苷酸含量，因此在動(dòng)物病毒中是獨(dú)一無二的。HDV基因組以反義單鏈閉合環(huán)狀RNA的形式存在，它的核苷酸序列具有70％的自我互補(bǔ)性，使基因組可以形成部分雙鏈的桿狀RNA結(jié)構(gòu)。HDV具有約1700個(gè)核苷酸的基因組，是已知感染動(dòng)物的最小“病毒”。有人提出，HDV可能由一類叫做類病毒(Viroid)的植物病原體進(jìn)化而成。

病毒生活周期

? ? ? ? 像乙肝病毒一樣，丁肝病毒通過NTCP膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入肝細(xì)胞。丁肝病毒通過乙肝表面抗原(HBsAg)的N端結(jié)構(gòu)域識別其受體。該區(qū)域的突變定位顯示，氨基酸殘基9-15構(gòu)成了受體結(jié)合位點(diǎn)。在進(jìn)入肝細(xì)胞后，病毒未被包裹，核衣殼由于HDAg中的信號而易位到細(xì)胞核。由于丁肝病毒基因組不編碼RNA聚合酶來復(fù)制病毒的基因組，病毒利用宿主細(xì)胞的RNA聚合酶。最初被認(rèn)為僅使用RNA聚合酶II，現(xiàn)在RNA聚合酶I和III也被證明參與HDV的復(fù)制。通常RNA聚合酶II利用DNA作為模板并產(chǎn)生mRNA。丁肝病毒是唯一已知的能夠使用宿主RNA聚合酶作為RNA依賴的RNA聚合酶的動(dòng)物病原體。

? ? ? ? RNA聚合酶將RNA基因組作為雙鏈DNA處理，這是由于它是折疊的棒狀結(jié)構(gòu)。丁肝病毒RNA有三種形式：圓形基因組RNA、圓形互補(bǔ)的反基因組RNA和線性多聚腺苷化的反基因組RNA，這是包含HDAg開放閱讀框的mRNA。反基因組RNA的合成發(fā)生在核仁中，由RNA聚合酶I介導(dǎo)，而基因組RNA的合成發(fā)生在核漿中，由RNA聚合酶II介導(dǎo)。HDV RNA首先被合成為線性RNA，其中包含許多基因組的副本?；蚪M和反基因組RNA包含一個(gè)由85個(gè)核苷酸組成的序列，即丁肝病毒核酶，它作為一種核酶，可以將線性RNA自裂解成單體。這些單體然后連接形成環(huán)狀RNA。

德爾塔抗原

? ? ? ? 類病毒和HDV之間的顯著區(qū)別是，盡管類病毒不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，但HDV可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)，即HDAg。它有兩種形式：一個(gè)27kDa的HDAg-L和一個(gè)24kDa的HDAg-S。兩種形式的N末端相同，它們在HDAg-L的C末端相差19個(gè)氨基酸。兩種同工型都是從同一閱讀框產(chǎn)生的，該閱讀框在196位密碼子處包含一個(gè)UAG終止密碼子，通常僅產(chǎn)生HDAg-L。然而，通過宿主細(xì)胞腺苷脫氨酶-1的編輯將終止密碼子更改為UGG，從而可以產(chǎn)生HDAg-L。盡管具有90％相同的序列，但這兩種蛋白在感染過程中起著不同的作用。HDAg-S在感染的早期產(chǎn)生，并進(jìn)入細(xì)胞核并支持病毒復(fù)制。相反，HDAg-L是在感染后期產(chǎn)生的，可作為病毒復(fù)制的抑制劑，是病毒顆粒組裝所必需的。因此，細(xì)胞酶系對RNA的編輯對于病毒的生命周期至關(guān)重要，因?yàn)樗{(diào)節(jié)了病毒復(fù)制和病毒體裝配之間的平衡。

抗原性環(huán)

? ? ? ? HDV包膜蛋白具有三個(gè)錨定在其上的HBV表面蛋白?；蚪M的S區(qū)最常表達(dá)，其主要功能是組裝亞病毒顆粒。 HDV抗原蛋白可與病毒基因組結(jié)合形成核糖核蛋白（RNP），當(dāng)被病毒樣顆粒包裹時(shí)，可形成與成熟HDV幾乎相同的病毒樣顆粒，但它們沒有傳染性。研究人員得出結(jié)論，HDV的傳染性決定因素在大蛋白（L）的N末端pre-S1域內(nèi)。發(fā)現(xiàn)它是與細(xì)胞受體結(jié)合的介質(zhì)。最近，研究人員Georrges AbouJaoudé和Camille Sureau發(fā)表了一篇文章，研究了在HDV包膜蛋白中發(fā)現(xiàn)的抗原環(huán)在病毒的傳染性中的作用。像大蛋白的N端pre-S1結(jié)構(gòu)域一樣，抗原環(huán)也暴露在病毒體表面。 Jaoudé和Sureau的研究提供了證據(jù)，表明抗原性環(huán)可能是HDV進(jìn)入宿主細(xì)胞的重要因素，并且通過突變抗原性環(huán)的某些部分，可以將HDV的感染力降至最低。

傳染方式

? ? ? ? HDV的傳播途徑與HBV相似。感染主要限于HBV高危人群，尤其是注射吸du者和接受凝血因子濃縮劑的人群。在全球范圍內(nèi)，有超過1500萬人被共同感染。HDV在大多數(shù)發(fā)達(dá)國家很少見，并且主要與靜脈吸du有關(guān)。然而，HDV在地中海地區(qū)、撒哈拉以南非洲、中東和南美北部地區(qū)更為普遍。總共可能有大約2000萬人感染了HDV。防護(hù)措施HBV疫苗可預(yù)防HDV，因?yàn)楹笳咭蕾囉诖嬖诘腍BV才能復(fù)制。因?yàn)闆]有針對丁肝病毒的特定疫苗，所以必須在出生后不久在危險(xiǎn)人群中接種針對HBV的疫苗。

發(fā)現(xiàn)歷史

? ? ? ? 丁肝病毒最早于1977年中報(bào)道，是患有嚴(yán)重肝病的HBV感染患者的一種核抗原。然后，該核抗原被認(rèn)為是HBV抗原，被稱為德爾塔抗原。隨后在黑猩猩中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，德爾塔抗原（HDAg）是病原體的結(jié)構(gòu)部分，需要HBV感染才能復(fù)制。整個(gè)基因組在1986年被克隆并測序。隨后將其置于自己的屬中：丁肝病毒(Deltavirus)。在鴨子中也有類似的病毒，禽丁肝病毒中編碼的蛋白質(zhì)與丁肝病毒具有32％的同源性。蛇中還發(fā)現(xiàn)了另一種類似的病毒，它被命名為蛇丁肝病毒(Snake Deltavirus)。

以下四種病毒也被發(fā)現(xiàn)：

1.白蟻HDV抗原(寄主：長鼻白蟻/Schedorhinotermes intermedius)

2.蟾蜍HDV抗原(寄主：中華大蟾蜍)

3.蠑螈(Newt)HDV抗原(寄主：東方蠑螈)

4.魚類HDV抗原

丁肝病毒抗原型

丁肝病毒共有八個(gè)抗原型：

抗原1.HDV-1/DV-A/DVA(世界廣泛分布)

抗原2.HDV-2/DV-B/DVB(分布于東亞、東北亞)

抗原3.HDV-3/DV-C/DVC(分布于南美洲北部)

抗原4.HDV-4/DV-D/DVD(分布于東洋)

抗原5.HDV-5/DV-E/DVE(分布于西非幾內(nèi)亞灣沿岸)

抗原6.HDV-6/DV-F/DVF(分布于剛果河沿岸)

抗原7.HDV-7/DV-G/DVG(分布于剛果河沿岸)

抗原8.HDV-8/DV-H/DVH(分布于剛果河沿岸)

丁肝病毒核酶(Hepatitis Deltavirus Ribozyme/HDV-Rz)

? ? ? ??丁肝病毒是唯一已知的擁有核酶活性的人類病毒。丁肝病毒核酶(HDV-Rz)是在丁肝病毒中發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，是病毒復(fù)制所必需的，在丁肝病毒的復(fù)制過程中，丁肝病毒核酶通過自我切割反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄物加工成單位長度，據(jù)認(rèn)為是通過雙滾環(huán)機(jī)制的。丁肝病毒核酶在沒有任何蛋白質(zhì)因子的情況下在體內(nèi)具有活性，并且在發(fā)現(xiàn)時(shí)是已知最快的自然發(fā)生的自我裂解RNA。

? ? ? ?后來，錘頭狀核酶(Hammerhead Ribozyme)也被發(fā)現(xiàn)。

? ? ? 丁肝病毒核酶的晶體結(jié)構(gòu)已使用X射線晶體學(xué)進(jìn)行了解析，并顯示了由一個(gè)雙假結(jié)連接的五個(gè)螺旋段。

? ? ? 除了正義基因組版本，所有丁肝病毒病毒還具有丁肝病毒核酶的反基因組版本。該版本不是確切的互補(bǔ)序列，但采用與正義基因組相同的結(jié)構(gòu)。兩者之間唯一的“顯著”差異是P4莖上的小凸起和較短的J4/2接頭?；蚪M核酶和反基因組核酶都是復(fù)制所必需的。

丁肝病毒樣核酶

? ? ? ?丁肝病毒核酶在結(jié)構(gòu)和生化上與許多其他自切割核酶有關(guān)。 由于這些相似性，即使在丁肝病毒中未發(fā)現(xiàn)這些其他核酶，也經(jīng)常將其稱為丁肝病毒核酶的實(shí)例。 它們也可以稱為“丁肝病毒樣”以表明這一事實(shí)。
? ? ?? 類似于丁肝病毒核酶的核酶包括哺乳動(dòng)物CPEB3核酶，逆轉(zhuǎn)座子成員(例如昆蟲和L1Tc中的R2 RNA元件以及錐蟲的可能的其他逆轉(zhuǎn)座子)和細(xì)菌序列。這種分組可能是趨同進(jìn)化的結(jié)果：在發(fā)現(xiàn)的非人類丁肝病毒也具有丁肝病毒核酶，并且尚無提出的水平基因轉(zhuǎn)移方案可以解釋這一點(diǎn)。

催化機(jī)理

? ? ? ??丁肝病毒核酶催化底物核苷酸或寡核苷酸與核酶的5'-羥基之間磷酸二酯鍵的斷裂。在丁肝病毒中，這種底物核苷酸序列始于尿苷，被稱為U(-1)，然而，-1核苷酸的身份并不會顯著改變催化速率。這只對它的化學(xué)性質(zhì)有要求，因?yàn)檎鏟errotta和Been所示，U(-1)核糖被脫氧核糖取代會使反應(yīng)廢去，這與化學(xué)反應(yīng)中2'-羥基是親核試劑的預(yù)測是一致的。因此，與其他許多核酶(如錘頭核酶)不同，丁肝病毒核酶沒有催化的上游要求，只需要一個(gè)單一的-1核糖核苷酸作為底物即可有效反應(yīng)。

? ? ? ?最初，人們認(rèn)為核酶中的第75個(gè)核苷酸，一種稱為C75的胞嘧啶，能夠作為一般堿，C75的N3從U(-1)核苷酸的2'-羥基上提取一個(gè)質(zhì)子，以促進(jìn)對磷酸二酯鍵的親核攻擊。然而，雖然已經(jīng)確定C75的N3的pKa偏離了正常值4.45，接近于6.15或6.40，但它還不夠中性，不能作為一般的堿催化劑。相反，C75的N3被認(rèn)為是一種劉易斯酸，以穩(wěn)定核糖酶的剩余5'-羥基;這是因?yàn)樗拷w結(jié)構(gòu)中的5'-羥基。如果C75核苷酸被其他核苷酸取代，則核酶的活性會被抵消或顯著削弱，盡管這種活性可以通過咪唑部分恢復(fù)，進(jìn)一步說明C75在催化活性中的作用。

? ? ? ?丁肝病毒核酶中的C75因其特有的pKa而一直是研究的對象。游離核苷的典型pKa值在3.5到4.2之間；這些較低的pKa值是酸性的，不太可能變成堿性的。然而，核糖酶內(nèi)部的結(jié)構(gòu)環(huán)境，包括一個(gè)溶解的活性位點(diǎn)裂口，可能提供了負(fù)靜電勢，這可能會擾亂胞嘧啶的pKa，足以起到路易斯酸的作用。

? ? ? ? 除了對5'-羥基離開基的路易斯酸穩(wěn)定外，現(xiàn)在也認(rèn)為丁肝病毒核酶可以利用金屬離子協(xié)助激活2'-羥基來攻擊U(-1)核苷酸。核酶活性部位的一個(gè)鎂離子與2'-羥基親核試劑和易剪切磷酸鹽的一個(gè)氧相協(xié)調(diào)，并可作為路易斯酸激活2'-羥基。此外，U23的磷酸可以作為一個(gè)路易斯酸，從2'-羥基接受一個(gè)質(zhì)子，鎂作為配位離子。由于丁肝病毒核酶不需要金屬離子才能具有活性，因此它不是一種專性的金屬酶，但活性部位鎂的存在顯著改善了裂解反應(yīng)。丁肝病毒核酶似乎對低數(shù)量的二價(jià)陽離子的折疊具有非特異性要求，在Mg2+、Ca2+、Mn2+和Sr2+中具有活性。在沒有金屬離子的情況下，水似乎可以取代鎂作為一種路易斯酸的作用。

來自上游RNA的調(diào)控

? ? ?? 受丁肝病毒核酶快速自裂解性質(zhì)的限制，以前的核糖核酸酶實(shí)驗(yàn)是在自裂解的3'產(chǎn)物而不是前體上進(jìn)行的。然而，已知側(cè)翼序列參與調(diào)節(jié)丁肝病毒核酶的自切割活性。因此，已經(jīng)整合了自切割位點(diǎn)的上游序列5'來研究HDV核酶的最終自切割活性。已經(jīng)確定了兩種替代結(jié)構(gòu)。
? ? ?? 第一個(gè)抑制性結(jié)構(gòu)被一個(gè)擴(kuò)展的轉(zhuǎn)錄物折疊（即-30/99轉(zhuǎn)錄物，參照自身切割位點(diǎn)的座標(biāo)），從切割位點(diǎn)上游的30 nt到3'端下游的15 nt延伸。在轉(zhuǎn)錄過程中，側(cè)翼序列將核酶隔離在動(dòng)力學(xué)陷阱中，并導(dǎo)致自我切割率大大降低。這種防止自我切割的結(jié)構(gòu)包括3個(gè)備選莖：Alt1，Alt2和Alt3，它們破壞了活性構(gòu)象。 Alt1是一個(gè)10bp的長距離相互作用，由抑制性上游區(qū)段(-25/-15nt)和下游區(qū)段(76/86nt)形成。Alt1破壞了莖的P2活性構(gòu)象，其中P2被認(rèn)為對基因組和反基因組核酶都具有激活作用。Alt2是上游側(cè)翼序列與核酶之間的相互作用，而Alt3是非天然核酶-核酶之間的相互作用。
? ? ? ? 各種實(shí)驗(yàn)方法都支持這種抑制構(gòu)象的二級結(jié)構(gòu)。首先，進(jìn)行了通過核糖核酸酶的直接探測，隨后使用來自探測結(jié)果的約束通過mfold 3.0進(jìn)行的建模與所提出的結(jié)構(gòu)一致。其次，使用一系列與AS1/2不同區(qū)域互補(bǔ)的DNA寡聚物來拯救核酶的活性。結(jié)果證實(shí)了AS1/2的抑制作用。第三，突變分析在核酶之外引入了單/雙突變，以確保觀察到的核酶活性與Alt1的穩(wěn)定性直接相關(guān)。發(fā)現(xiàn)AS1的穩(wěn)定性與自我切割活性成反比。
? ? ? ? 第二個(gè)允許結(jié)構(gòu)使丁肝病毒核酶能夠自我轉(zhuǎn)錄共轉(zhuǎn)錄，并且該結(jié)構(gòu)還包括RNA轉(zhuǎn)錄本的-54/-18nt部分。來自上述抑制構(gòu)象的上游抑制性-24/-15片段現(xiàn)在被隔離在位于裂解位點(diǎn)上游的發(fā)夾P(-1)中。然而，P(-1)基序僅存在于基因組序列中，這可能與被感染的肝細(xì)胞中基因組HDV RNA拷貝更為豐富的現(xiàn)象有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)也支持這種替代結(jié)構(gòu)。首先，由于該結(jié)構(gòu)的快速切割性質(zhì)，通過核糖核酸酶的結(jié)構(gòu)定位被用來探測-54/-1片段而不是整個(gè)前體轉(zhuǎn)錄物，這與局部發(fā)夾P(-1)(在-54/-40和-18/-30nt)。其次，在21個(gè)基因組HDV RNA分離株中，在P(-1)以及P(-1)和P1之間的連接區(qū)域發(fā)現(xiàn)了進(jìn)化保守性。

用于RNA轉(zhuǎn)錄本制備

? ? ? ? 丁肝病毒核酶裂解反應(yīng)的特殊性質(zhì)使其成為制備具有均質(zhì)3'端RNA轉(zhuǎn)錄物的有用工具，這是用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄RNA的替代方法——T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄RNA時(shí)通常會產(chǎn)生異質(zhì)末端或不希望的添加。核酶的cDNA版本可以與目標(biāo)RNA序列的cDNA和通過T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄制備的RNA相鄰制備。核酶序列將有效地自我切割，而無需下游要求，因?yàn)?1核苷酸是不變的，留下了一個(gè)2'-3'環(huán)狀磷酸酯，可以通過用磷酸酶或T4多聚核苷酸激酶處理輕松去除。然后可以通過凝膠純化來純化靶RNA。