mRNA新冠疫苗的巨大成功重新喚起了人們對于使用mRNA表達治療性蛋白質(zhì)的興趣。除了mRNA新冠疫苗以外，使用mRNA表達血管內(nèi)皮生長因子 （VEGF） 來治療心力衰竭，以及基于CRISPR-Cas9 mRNA 治療罕見遺傳病的mRNA已經(jīng)開始了一系列臨床試驗。
然而，在mRNA被確立為一種治療罕見和常見疾病的通用治療方式之前，仍有一系列挑戰(zhàn)有待解決。為了克服這些挑戰(zhàn)，科學(xué)家們正在開發(fā)一系列新技術(shù)，包括優(yōu)化mRNA序列、開發(fā)具有器官/組織特異性的脂質(zhì)載體，以及體內(nèi)經(jīng)皮給藥系統(tǒng)。這些進展的結(jié)合，有望解鎖mRNA療法的前景，將mRNA療法超越疫苗，用于治療多種疾病類型。 近日，Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Unlocking the promise of mRNA therapeutics 的綜述論文， 從mRNA的設(shè)計和純化、提高mRNA表達時間和水平、改進mRNA的遞送系統(tǒng)、組織特異性遞送系統(tǒng)、重復(fù)給藥策略等方面討論了如何解鎖mRNA療法的前景，并總結(jié)了當(dāng)前mRNA療法的臨床趨勢。
mRNA新冠疫苗在全世界已經(jīng)接種了數(shù)十億人次，其安全性和有效性得到了廣泛驗證，也提示了我們開發(fā)疫苗以外的新一代mRNA療法的潛力。
mRNA疫苗與mRNA療法的不同之處 與mRNA疫苗相比，mRNA療法的開發(fā)面臨著更多挑戰(zhàn)。因為mRNA疫苗只需要產(chǎn)生少量蛋白質(zhì)，人體免疫系統(tǒng)會通過 細胞和抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)放大免疫信號。而mRNA療法需要mRNA疫苗所表達的1000倍以上的蛋白質(zhì)水平才能達到治療閾值。
而且，通常情況下，mRNA療法需要作用于 特定的靶通路、細胞、組織或器官。因此需要重視靶細胞對mRNA的吸收，這決定了mRNA表達的持續(xù)時間和水平。脂質(zhì)載體遞送到組織中的生物利用度、循環(huán)半衰期和遞送效率，都時限速因素。
通過靜脈注射，可以很容易讓mRNA療法靶向肝臟，但將其有效遞送到其他實體器官仍然具有挑戰(zhàn)性。此外，重復(fù)給藥目前也面臨障礙，對于慢性疾病的治療而言，通常需要多次給藥，但即使優(yōu)化過的mRNA和LNP在多次給藥后也會激活先天免疫，從而降低治療性單白的表達。
mRNA疫苗與mRNA療法 提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量
mRNA固有的免疫原性雖然增強了其作為疫苗的效力，但這也阻礙了其作為療法的潛力。mRNA療法需要高水平的蛋白表達以達到治療效果，在用于酶替代療法、局部再生療法和腫瘤免疫療法的小鼠模型中，通常需要比mRNA疫苗高50-1000倍的使用劑量。對于高蛋白表達水平的需求導(dǎo)致了多種優(yōu)化mRNA的策略，以最小化免疫反應(yīng)，增強mRNA穩(wěn)定性和最大化翻譯效率。 下圖是目前臨床應(yīng)用或正在研究的提高蛋白質(zhì)表達效率的mRNA的不同修飾示意圖。mRNA由五個主要結(jié)構(gòu)域組成——5'端帽子 （5' cap） 、5'端非翻譯區(qū) （5'UTR） 、開放閱讀框 （ORF） 、3'端非翻譯區(qū)（3'UTR） 、Poly(A)尾巴 （PolyA） 。對這5個結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化都可以增強蛋白質(zhì)表達水平。
mRNA不同結(jié)構(gòu)的優(yōu)化 對UTR的優(yōu)化有利于mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。來自高表達基因的UTR序列，例如人α-珠蛋白基因或人β-珠蛋白基因的UTR被廣泛用于mRNA合成，因為含有這些UTR的mRNA通常具有高水平的翻譯和穩(wěn)定性。通過高通量篩選或深度學(xué)習(xí)來識別新的UTR序列，可以提高mRNA的表達，合理組合5' UTR和3' UTR可以使翻譯效率最大化。此外，長度為100-150個核苷酸的Poly(A)尾巴可以提高mRNA的穩(wěn)定性，并通過與Poly(A)結(jié)合蛋白形成復(fù)合物來有效地啟動翻譯。
對于mRNA疫苗和mRNA療法來說，最關(guān)鍵的進展或許就是發(fā)現(xiàn)對核苷的化學(xué)修飾可以顯著降低mRNA的免疫原性、增加蛋白質(zhì)表達水平。這也是迄今為止mRNA領(lǐng)域?qū)＠髻r的核心。除了對mRNA進行化學(xué)修飾以外，對mRNA序列進行密碼子優(yōu)化，也有望開發(fā)出有效的、無需化學(xué)修飾的治療性mRNA。
除了蛋白質(zhì)表達水平之外，mRNA療法在治療慢性疾病時的一個關(guān)鍵限制因素是其蛋白質(zhì)生產(chǎn)時間較短，因此需要重復(fù)給藥。目前有幾種對mRNA結(jié)構(gòu)的優(yōu)化以提高其表達蛋白質(zhì)的持續(xù)時間，例如自擴增mRNA （saRNA） 和環(huán)狀mRNA （circRNA） 。 自擴增mRNA （saRNA） 利用RNA甲病毒的自我復(fù)制能力，可以在細胞內(nèi)進行自我復(fù)制，從而減少給藥量和頻率， 與線性且修飾的mRNA相比，在蛋白質(zhì)表達水平相似的情況下，自復(fù)制mRNA用量只需前者的十分之一。目前已有多款自擴增mRNA新冠疫苗正在臨床試驗中。此外，自擴增mRNA還有另一種形式——反式擴增mRNA （taRNA） ，將復(fù)制酶和目標(biāo)基因放在兩個mRNA上，更安全，而且有助于減少mRNA的大小。 環(huán)狀mRNA （circRNA） ，將線性mRNA進行環(huán)化，能夠防止mRNA被外切酶降解，延長mRNA在細胞內(nèi)的半衰期，從而增加其蛋白質(zhì)表達總量。而且環(huán)狀mRNA避免了線性mRNA必須添加的昂貴的5'端帽子和繁瑣的Poly(A)尾巴。此外，環(huán)狀mRNA無需進行化學(xué)修飾就能顯著降低免疫反應(yīng)。
不同的mRNA形式
需要注意的是，對mRNA的純化，減少副產(chǎn)物雙鏈RNA （dsRNA） ，不僅能夠減低免疫反應(yīng)，還能提高蛋白質(zhì)表達水平。
遞送載體系統(tǒng) mRNA固有的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致了需要一個包裝/遞送系統(tǒng)來保護mRNA不被核酸酶降解，并允許其被細胞吸收、在細胞內(nèi)釋放、翻譯成蛋白質(zhì)。
mRNA在細胞內(nèi)的遞送和翻譯
LNP遞送系統(tǒng)
目前已上市的和在研的mRNA疫苗/療法大多使用脂質(zhì)納米顆粒 （LNP） 作為載體，LNP在60多年前被首次提出，此后經(jīng)歷了許多改變和進步，最終首次在臨床上用于遞送siRNA療法。LNP由4種關(guān)鍵組分：結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)、膽固醇、陽離子或可電離脂質(zhì)、隱形脂質(zhì)。 結(jié)構(gòu)性脂類是LNP的基本支架 ，以不同比例加入膽固醇可穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)，并可調(diào)節(jié)其性質(zhì)，如膜流動性、彈性和滲透性。陽離子脂質(zhì)或可電離脂質(zhì)是將帶負電的mRNA裝載到LNP所必不可少的。隱形脂質(zhì)主要是聚乙二醇 （PEG） 修飾的脂質(zhì)，它的加入能夠降低LNP免疫原性、增加穩(wěn)定性。但值得注意的是有些人對PEG過敏，這為慢性疾病治療中的反復(fù)給藥帶來障礙。因此，優(yōu)化聚乙二醇（PEG） 修飾的脂質(zhì)或開發(fā)其他的隱身脂質(zhì)，是目前的研究重點。
LNP的發(fā)展里程碑 同時，基于細胞、細胞外囊泡和仿生囊泡的其他遞送載體正在開發(fā)中，并作為替代載體在臨床前研究中得到了驗證。
細胞遞送系統(tǒng) LNP的一種替代方法是使用生物遞送載體，例如細胞。 這種方法是利用細胞旁分泌功能，直接在體外將mRNA合成的蛋白質(zhì)引入細胞，而不是將mRNA遞送到目標(biāo)細胞。與人工合成的LNP相比，細胞載體具有許多優(yōu)點，包括更高的生物相容性、更長的循環(huán)壽命，以及具有內(nèi)源性細胞內(nèi)/細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 細胞被用作藥物載體，將酶、治療藥物或脂質(zhì)顆粒遞送到目標(biāo)部位。通過將mRNA引入各種可用的細胞類型 （例如，免疫細胞、紅細胞和間充質(zhì)細胞） 和進一步的基因工程，可以進行廣泛的定制。這種方法也可以與現(xiàn)有的細胞療法結(jié)合，以增強治療效果。然而，基于細胞的mRNA療法的遞送可能受到細胞療法通常存在的限制，如組織相容性問題、生產(chǎn)問題、繁瑣的質(zhì)量控制，以及細胞內(nèi)遞送能力等等。
細胞外囊泡遞送載體
細胞外囊泡 （EV） 也是一類被廣泛研究的新型遞送載體，這是一類細胞分泌的雙層膜狀結(jié)構(gòu)，通?？煞譃?類：外泌體 （直徑50-150納米） 、凋亡小體 （直徑大于1微米） 和微泡 （直徑50-500納米） 。
細胞外囊泡在全身的細胞間通訊起著至關(guān)重要的作用，它們可以攜帶和運送各種各樣的貨物，從代謝物、短核酸和氨基酸，到長mRNA和蛋白質(zhì)。作為天然囊泡，它們在給藥方面具有多種優(yōu)勢，如生物相容性和低免疫原性。目前，細胞外囊泡，尤其是外泌體在腫瘤和心血管疾病的診斷、預(yù)后和治療方面得到了廣泛研究。 與以細胞為基礎(chǔ)的遞送系統(tǒng)類似，細胞外囊泡的細胞來源對其潛在應(yīng)用至關(guān)重要。細胞外囊泡可以從其來源細胞那里“繼承”特性， 來自血細胞的細胞外囊泡在全身給藥后保持其穿透血腦屏障 （BBB） 的能力，來自間充質(zhì)干細胞的細胞外囊泡具有類似的抗炎和旁分泌特性。此外，臨床前研究表明，來自各種細胞類型的細胞外囊泡不會誘導(dǎo)毒性，并在重復(fù)給藥后具有良好的耐受性。因此，細胞外囊泡可作為一種可重復(fù)給藥的遞送載體，但其在應(yīng)用中還面臨著分離和高效裝載的挑戰(zhàn)。
2021年8月，張鋒 團隊開發(fā)了一種新的RNA遞送平臺——SEND ，其核心是逆轉(zhuǎn)錄病毒樣蛋白PEG10 ，它能夠與自身的mRNA結(jié)合并在其周圍形成球型保護囊。 SEND系統(tǒng)能夠?qū)RISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)遞送到小鼠和人類細胞并成功編輯目標(biāo)基因。這為基因治療提供一種全新的遞送載體，與其他遞送載體相比，所引起的免疫反應(yīng)更少，更具安全性。詳情： 仿生遞送系統(tǒng)
仿生遞送系統(tǒng)結(jié)合了生物材料和合成材料，例如使用合成材料（ 包括金納米顆粒、二氧化硅、LNP或其他聚合物） 作為核心來封裝mRNA，然后用細胞膜包裹。外層的細胞膜減輕了合成材料的免疫原性，而細胞來源的材料具有組織靶向性，還能增加整個系統(tǒng)的穩(wěn)定性。外層細胞膜可以來自紅細胞、血小板、免疫細胞、干細胞、腫瘤細胞和間充質(zhì)干細胞等各種細胞，還可以使用多種細胞類型的雜合膜。這種系統(tǒng)目前還處于研究的早期階段，具體生物學(xué)機制還不十分清楚，還缺少成熟的生產(chǎn)制造標(biāo)準(zhǔn)。
LNP、細胞外囊泡、細胞和仿生載體的優(yōu)勢及面臨的挑戰(zhàn)
組織特異性靶向
要實現(xiàn)mRNA療法的全部潛力，就需要更先進的體內(nèi)遞送系統(tǒng)，特別是對于心臟、腎臟、大腦和肺等實體器官的特異性遞送。目前，肝臟是大多數(shù)分子療法的首選器官，其豐度的血管系統(tǒng)有利于有效的均勻遞送和大顆粒的通過。因此，簡單的靜脈注射就可以將mRNA高效遞送到肝臟細胞并表達出治療性蛋白質(zhì)。然而，針對肝臟以外的器官，目前還需要改進遞送系統(tǒng)以提高遞送效率。
注射、吸入和鼻內(nèi)給藥
腎臟 與肝臟不同，它會過濾掉大分子，只允許小分子通過。腎小球主動清除50 kDa以上的蛋白質(zhì)，腎小球足細胞形成直徑不足10納米的濾過裂隙，阻礙了大多數(shù)從血液循環(huán)到腎臟的分子療法。因此，需要直接通過導(dǎo)管向腎臟髓質(zhì)或皮質(zhì)注射來進行遞送。有研究顯示，可以通過這種方式對腎臟進行基因治療或寡核苷酸治療。
目前還沒有針對腎臟的mRNA療法進入臨床，但有兩項治療腎臟疾病的miRNA療法正在臨床試驗中。一種是靶向miR21的寡核苷酸抑制劑，用于治療Alport綜合征 （一種遺傳性腎?。?/span>，目前處于2期臨床試驗階段。另一種是靶向miR17的寡核苷酸抑制劑，用于治療常染色體顯性多囊腎病，目前處于1期臨床試驗階段。
對于肺部 而言，可通過吸入立即到達，允許使用較低的藥物劑量，從而減少全身遞送帶來的副作用。吸入遞送可以直接、快速、無創(chuàng)地進入肺泡和肺實質(zhì)，而且肺部的核酸酶活性低于血清。但吸入給藥也面臨著特殊的挑戰(zhàn)，mRNA必須高度濃縮，以承受氣霧化過程中的剪切力。肺上皮表面的大表面積 （約100平方米） 和保護性粘膜的存在也是高效遞送mRNA的天然屏障。因此，要想實現(xiàn)靶向肺部的mRNA療法，就必須保持mRNA的完整性，使其穿過黏膜、進入細胞，釋放mRNA并表達蛋白質(zhì)。 一項通過吸入編碼囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子 （CFTR） 的mRNA療法在治療囊性纖維化的1/2期臨床試驗中顯示了很好的安全性，但肺部功能并未得到明顯改善。 大腦 是人體最復(fù)雜的器官，也是最難治療的器官。它被頭骨和腦膜保護著，而且還存在著特殊的血腦屏障 （BBB） 系統(tǒng)，血腦屏障的存在嚴(yán)重限制了藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng) （CNS） 的遞送。目前主要的努力方向是改變血腦屏障或繞過血腦屏障，通過直接注射到腦實質(zhì)或腦脊液來提供治療。但注射到腦脊液很難均勻靶向大腦，而直接注射到腦實質(zhì)限制了藥物在注射部位附近的遞送。而且這些都是高風(fēng)險的侵入式手術(shù)，需要很高的技術(shù)水平，限制了在換這種的廣泛應(yīng)用。
連接鼻黏膜和大腦的神經(jīng)通路為非侵入性藥物遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供了潛在的途徑，鼻子到大腦的神經(jīng)通路能夠在幾分鐘內(nèi)將治療藥物快速遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，低分子量 （<1kDa） 和高親脂性的藥物有利于鼻內(nèi)快速進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。對于大分子藥物，可以通過滲透促進劑來提高其生物利用度，針對大鼠的臨床前研究顯示，VEGF （分子量38.2 kDa） 可在30分鐘內(nèi)通過鼻內(nèi)給藥直接遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，針對小鼠的臨床前研究顯示，鼻內(nèi)給藥陽離子脂質(zhì)體包裹的mRNA可有效遞送到特定的大腦區(qū)域。 將治療性藥物遞送到大腦尤其具有挑戰(zhàn)性，因為遞送到達靶點并不能保證成功，大腦內(nèi)皮細胞的P-糖蛋白還可能將遞送進來的藥物迅速排出。因此還需要增強特異性已到達特定大腦細胞類型。 在臨床上，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了治療脊髓性肌萎縮癥 （SMA） 的Spinraza療法，這是一款反義寡核苷酸 （ASO） 療法，通過腦脊液直接注射治療，這也是FDA批準(zhǔn)的第一款治療脊髓性肌萎縮癥（SMA） 的藥物。但備受期待的治療漸凍癥 （ALS） 的ASO療法Tofersen的3期臨床試驗失敗了。
導(dǎo)管遞送系統(tǒng) 自1929年 Werner Fossmann 首次成功應(yīng)用心臟導(dǎo)管術(shù)以來，基于心臟導(dǎo)管的治療已經(jīng)成為現(xiàn)代心臟病學(xué)的一個組成部分，使冠狀動脈疾病、瓣膜疾病和結(jié)構(gòu)畸形的有效治療成為可能。
在基因治療和細胞治療背景下，以心臟導(dǎo)管為基礎(chǔ)的遞送系統(tǒng)得到了廣泛探索。由于心臟是心血管系統(tǒng)的中心器官，有多種途徑可通過血管內(nèi)接近心臟：通過心室導(dǎo)管經(jīng)心內(nèi)膜注射，通過冠狀靜脈導(dǎo)管經(jīng)心外膜注射，以及冠狀動脈內(nèi)灌注和逆行性冠狀靜脈灌注。在過去的十年里，這些技術(shù)有了很大的進步，經(jīng)血管壁微導(dǎo)管可以將細胞和其他治療藥物直接注入心臟組織中，提高療效并降低不良事件的風(fēng)險。這種血管內(nèi)裝置的臨床前研究表明，它可以直接進入靶組織，包括心臟、腎臟和胰腺，而不需要封閉穿刺部位。
此外，還可以通過減少導(dǎo)管直徑、優(yōu)化輸液參數(shù)、添加回流抑制功能來阻止沿導(dǎo)管的回流，來實現(xiàn)更小的侵入性。未來導(dǎo)管還會隨著微電子元件的發(fā)展集成更多功能，例如通過磁性傳感器和微型相機添加導(dǎo)航和定位功能。這些設(shè)備能夠適應(yīng)mRNA療法的需求，未來也可以與靶向特定細胞的遞送系統(tǒng)相結(jié)合。
工 程化遞送系統(tǒng)
迄今為止，針對RNA的封裝和遞送系統(tǒng)的設(shè)計通常聚焦在高遞送效率、低免疫原性和細胞毒性，很少關(guān)注細胞特異性。因此，研究不同包裝系統(tǒng)的體內(nèi)生物分布至關(guān)重要。早期脂質(zhì)納米顆粒 （LNP） 通過ApoE與膽固醇分子的結(jié)合被肝臟積極代謝，促進其被肝細胞吸收，類似于低密度脂蛋白 （LDL） 的肝臟代謝。添加聚乙二醇化脂質(zhì)可以減少LNP與ApoE的親和性，從而減少LNP在肝臟的積累。
改變LNP的組分可以實現(xiàn)器官選擇性靶向，例如2020年4月， 德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心 Daniel Siegwart 教授、程強 （現(xiàn)為北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院研究員） 、魏妥 （現(xiàn)為中科院動物所研究員） 等在 Nature Nanobitechnology 期刊發(fā)表論文，開發(fā)了一種新型選擇性器官靶向納米顆粒平臺—— SORT 。 SORT遞送系統(tǒng)通過在廣泛使用的四組分LNP系統(tǒng)添加陽離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)或可電離脂質(zhì)的第五種組分 （SORT） ，可使mRNA選擇性遞送到小鼠的肺、脾或肝臟。詳情： 破解器官選擇性mRNA遞送系統(tǒng)的機制
SORT系統(tǒng) 此外，通過體內(nèi)高通量篩選，也發(fā)現(xiàn)了具有組織和細胞特異性的新型LNP候選者，還可以通過外部刺激 （光、熱、磁或超聲波） 引導(dǎo)LNP與細胞的親和性。將LNP與特異性抗體結(jié)合，也可以實現(xiàn)更高的細胞特異性靶向。
長期重復(fù)給藥
在mRNA從疫苗向治療藥物過渡的過程中，能夠在保持高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的同時，特異性和高效地重復(fù)遞送能力是一個至關(guān)重要的要求。
蛋白質(zhì)替代療法就是一個生動的例子，例如在血友病的治療中，血友病患者由于基因突變?nèi)鄙倌鞍祝捎诘鞍踪|(zhì)半衰期短，通常只有12小時，因此患者需要每周注射3-7次凝血蛋白。而針對小鼠的臨床前研究顯示，每周注射一次0.2-0.5mg/kg劑量的修飾的線性mRNA就能保持有效的凝血蛋白水平。使用腺相關(guān)病毒 （AAV） 的血友病臨床試驗顯示，在注射后2年內(nèi)，蛋白質(zhì)表達穩(wěn)定。但一些最近的研究顯示，由于免疫系統(tǒng)對病毒載體的排斥，在注射5-7年后可能需要再次注射，而病毒載體有其自身的安全性問題，特別是在兒科疾病治療中。 與蛋白質(zhì)藥物相比，mRNA療法的真正價值是能夠在細胞內(nèi)合成高水平的治療性蛋白質(zhì)。mRNA療法可用于治療Crigler-Najjar綜合征、甲基丙二酸血癥、丙酸血癥和囊性纖維化等在技術(shù)上難以使用蛋白質(zhì)藥物的代謝類疾病。例如，目前針對丙酸血癥的治療是每天使用Carglumic Acid治療，雖然它緩解了體內(nèi)氨的毒性積累，但并不能治療代謝缺陷。相比之下，每三周兩次給藥的mRNA療法顯著改善了丙酸血癥小鼠模型的癥狀，目前已處于1期臨床試驗階段。
不同類型的mRNA療法
長期給藥的主要問題是如何在多年的每次給藥過程中保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定生產(chǎn)。大多數(shù)慢性蛋白質(zhì)療法會隨著針對蛋白質(zhì)或遞送載體的抗體的逐漸增加而失去療效。在對LNP遞送的mRNA的小鼠研究中，經(jīng)過3-6個月的長期慢性治療，帶把子表達水平幾乎沒有下降。但是一些研究顯示，在重復(fù)給藥后能夠檢測到抗藥物抗體，這提示了我們需要仔細選擇治療方案。
早期臨床研究主要關(guān)注LNP-mRNA的免疫反應(yīng)和細胞毒性反應(yīng)，體內(nèi)研究顯示，LNP組分中的可電離脂質(zhì)會引起炎癥，其中的聚乙二醇化脂質(zhì)也具有免疫原性，由于我們在生活中經(jīng)常接觸聚乙二醇產(chǎn)品 （例如藥物、牙膏和護膚品） ，因此大多數(shù)人對聚乙二醇的敏感性不斷增加。
在mRNA新冠疫苗接種中，小劑量的LNP-mRNA的局部遞送已經(jīng)可以觀察到炎癥并發(fā)癥，而mRNA療法需要高劑量的長期慢性給藥將放大炎癥并發(fā)癥。此外，一些臨床前研究顯示，在蛋白質(zhì)替代療法中，長期使用LNP-mRNA會帶來肝毒性。因此，需要在臨床前動物模型中精心設(shè)計研究方案并詳細監(jiān)測以解決這些問題。
mRNA療法的臨床研究 mRNA新冠疫苗已經(jīng)成功地完成了3期臨床試驗，并獲得了FDA的批準(zhǔn)，得到了廣泛應(yīng)用。而大多數(shù)mRNA療法仍處于早期的臨床1期研究解決，主要關(guān)注安全性問題。
臨床階段的mRNA療法
mRNA療法可以在全身系統(tǒng)或局部產(chǎn)生幾乎任何蛋白質(zhì)，因此具有廣泛的治療潛力，可通過mRNA表達的蛋白質(zhì)類型包括酶蛋白、受體、細胞內(nèi)蛋白、線粒體膜蛋白、分泌蛋白和基因編輯蛋白。
迄今為止，已有三項mRNA療法臨床研究在安全性和有效性方面都取得了令人鼓舞的結(jié)果，分別是治療心力衰竭的VEGF-mRNA療法，以及治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性 （ATTR） 和遺傳性血管水腫 （HAE） 的CRISPR/Cas9-mRNA療法。
VEGF-mRNA治療心力衰竭 基于血管內(nèi)皮生長因子 （VEGF） 的治療性血管生成已經(jīng)被實驗和臨床研究了幾十年。VEGF蛋白的半衰期太短，不到30分鐘，這限制了其直接作為蛋白質(zhì)療法的價值。而使用基因療法長期表達VEGF蛋白會帶來血管通透性過高的毒性作用。和許多旁分泌因子一樣，VEGF不是系統(tǒng)作用的，而是在局部以脈沖方式分泌，以劑量依賴性的方式到達靶細胞，然后迅速降解。 瑞典卡羅林斯卡學(xué)院的 Kenneth Chien 團隊進過長達10年的努力，在小鼠模型、大型動物和首次人類臨床研究中使用化學(xué)修飾的mRNA，證明了VEGF-mRNA可在數(shù)天內(nèi)的穩(wěn)定、短暫表達VEGF蛋白，這種短暫性表達自然限制了VEGF長期表達可能帶來的毒性作用。在心臟手術(shù)患者中進行的2a期臨床試驗顯示，直接向心臟注射VEGF-mRNA安全性良好，而且改善了患者的心臟功能，這表明mRNA療法在器官修復(fù)特別是心臟再生中具有很大潛力。
mRNA編碼的CRISPR基因編輯療法 2021年6月26日，Intellia Therapeutics 在國際頂尖醫(yī)學(xué)期刊《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》 （NEJM） 發(fā)表了首個體內(nèi)CRISPR基因編輯療法的臨床試驗結(jié)果，這項名為NTLA-2001的CRISPR-mRNA療法，通過LNP將攜帶靶向致病基因TTR基因的sgRNA和優(yōu)化的spCas9蛋白的mRNA序列遞送至肝臟，用于治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性 （ATTR） 。詳情：
這項臨床研究大大擴展了CRISPR基因編輯療法的應(yīng)用范圍，直接注射CRISPR-mRNA即可在體內(nèi)進行高效基因編輯，為許多遺傳疾病的治療開辟了新的途徑。 2022年6月24日，Intellia公布了NTLA-2001療法的最新1期臨床試驗中期數(shù)據(jù)，效果積極，單次給藥后患者血清中TTR蛋白水平的下降幅度在長達12個月時間里能夠穩(wěn)定持續(xù)。
2022年 11月12 日，Intellia宣布其第二款體內(nèi)CRISPR-mRNA基因編輯療法——NTLA-2002，在治療遺傳性血管水腫 （HAE） 的1/2期臨床試驗的中期數(shù)據(jù)積極。 10名接受不同劑量治療的遺傳性血管水腫 （HAE） 成年患者中，所有不同劑量（25mg、50mg、75mg） 治療的患者的 致病性的激肽釋放酶均顯著下降 ，分別在第32周、第22天、第16周時下降64%、81%、92%?；颊咴诮邮軉未沃委熀蠹膊“l(fā)作頻率顯著下降。詳情： 一次注射長期有效，第二款體內(nèi)CRISPR療法臨床數(shù)據(jù)發(fā)布 由于編碼Cas9的mRNA只是短暫表達，因此這種方法可能比更傳統(tǒng)的AAV病毒遞送的Cas9更安全，因為AAV會長期表達，可能會帶來不可預(yù)知的編輯結(jié)果。
隨著時間的推移，對遞送載體的改進，可能會讓CRISPR-mRNA療法超越肝臟，應(yīng)用于心臟、腎臟，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等其他實體器官的治療。
mRNA療法的范圍 盡管mRNA療法在大型動物以及臨床試驗中的長期安全性和有效性仍在研究中，但我們已經(jīng)可以 動物研究和已進行的少量后期臨床研究中看出mRNA療法在近期臨床發(fā)展的輪廓。
mRNA具有一系列固有優(yōu)勢，可以快速生成切割或多個候選mRNA，使其以獨立于細胞的形式存在，還易于創(chuàng)建mRNA組合。盡管目前基于LNP遞送mRNA進行全身長期給藥還存在調(diào)整，但一次性給藥似乎已經(jīng)很簡單了。
分泌蛋白定位于特定組織，例如腫瘤中，這是一個mRNA療法可行的機會。在未來幾年里，可能會有多種類似于VEGF的旁分泌因子通過局部、組織特異性給藥獲得臨床應(yīng)用。分泌或細胞內(nèi)抗體療法也是一個重要的機會，因為與重組蛋白相比，mRNA可實現(xiàn)大量抗體的長時間生成，還可以快速產(chǎn)生多種治療性抗體混合物。在細胞內(nèi)蛋白中，值得注意的機會包括代謝蛋白和線粒體蛋白，這是傳統(tǒng)療法難以解決的問題。
在組織特異性靶向方面，臨床研究表明，靜脈注射LNP-mRNA能夠在肝臟中高表達蛋白質(zhì)，而直接新肌內(nèi)注射的裸mRNA可在整個心臟中被攝取和表達。因此，將mRNA直接注射到各種實體器官的新興遞送系統(tǒng)可能會開辟新的靶點和臨床適應(yīng)癥。對于需要嚴(yán)格控制蛋白質(zhì)表達水平和持續(xù)時間的疾病，mRNA提供了一種劑量依賴性，能夠限制蛋白質(zhì)長期過表達或脫靶的CRISPR基因編輯的毒副作用，這是基于DNA的基因治療載體不容易實現(xiàn)的。 mRNA療法在慢性疾病治療中的應(yīng)用，需要解決的一個長期目標(biāo)是免疫原性問題。臨床前研究顯示， 與重組蛋白療法相比，mRNA療法具有更高的蛋白表達譜，而重組蛋白療法具有較少給藥的優(yōu)勢。在短期內(nèi)，鑒于mRNA在細胞內(nèi)快速表達蛋白質(zhì)的能力，mRNA療法可用于緊急治療，以幫助患有急性衰弱和危及生命的疾病的患者，如甲基丙二酸血癥。
除此之外，mRNA療法還有這許多創(chuàng)新應(yīng)用，例如通過mRNA短暫表達CXCR40來改善人類造血干細胞植入。以及通過靜脈注射LNP-mRNA來實現(xiàn)在體內(nèi)原位產(chǎn)生CAR-T細胞。mRNA的巨大潛力和多功能性很可能在未來引發(fā)更多研究和治療的新機會。
展望未來 最近30年來科學(xué)和臨床的進步，以及在mRNA新冠疫苗開發(fā)中的努力，預(yù)示著mRNA療法的美好未來。如今，我們已經(jīng)能夠在自動化、可擴展、無細胞的模式下，只通過點擊幾下鼠標(biāo)就能快速完成臨床級別的mRNA的設(shè)計和合成。
在不久的將來，我們還有可能生成模塊化、可擴展的GMP級制造單元，可以設(shè)置在任何GMP級設(shè)施中，從而消除對冷鏈運輸?shù)男枨?。以凍干形式儲存的mRNA療法也將出現(xiàn)，這將在很大程度上解決目前mRNA疫苗因運輸和保存難度帶來的分配問題。隨著新的LNP和非LNP載體的開發(fā)，其副作用也將得到改善。載體容量的增加，讓遞送復(fù)雜基因和堿基編輯變得可行，再加上可重復(fù)給藥，mRNA療法有望取代當(dāng)前的蛋白替代療法。 回顧重組蛋白療法的歷史，在這一領(lǐng)域的早期，人們預(yù)計大多數(shù)生長因子將成為藥物。然而，在VEGF被克隆30年后的今天，它是否會成為臨床有價值的治療手段仍然有待觀察。因此，mRNA療法的未來可能取決于將這種“生命的軟件”與人類生理系統(tǒng)的“硬件”相匹配，提高精度，在安全性條件延長持續(xù)時間，進行長期慢性給藥。 在未來的幾年里，mRNA、細胞內(nèi)載體和體內(nèi)遞送系統(tǒng)的快速發(fā)展，加上深入的生物學(xué)和臨床洞察力和直覺，應(yīng)該會為許多無法通過其他治療方式輕易滿足的臨床需求的患者帶來新的希望。 ABclonal
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