結(jié)果

鑒定與預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)的 ARG 和 ERG

最初，從GeneCards和GSEA下載ARG和ERG，隨后分別選擇diff-ARG和diff-ERG然后，從TCGA獲取COAD患者的臨床預(yù)后數(shù)據(jù)，隨后使用單變量Cox分析將152個diff-ARG和125個diff-ERG與臨床數(shù)據(jù)結(jié)合（P<0.05），最終獲得12個與預(yù)后相關(guān)的ARG （TIMP1、BDNF、IGF1、CDKN2A、MTA1、NAT1、INHBB、CD24、CD36、TRAF2、NOTCH3、PPP2R2A）和 11 個預(yù)后相關(guān) ERG（BGN、CXCL1、FSTL3、GPC1、MMP3、OXTR、PCOLCE2、SCG2、SERPINE1、 SERPINH11、TPM2)。此后，測定了TCGA中521個COAD樣本（41個正常樣本和480個腫瘤樣本）中23個基因的表達(dá)水平，并獨(dú)立繪制了箱線圖，表明這些基因在健康組織和惡性組織之間存在差異表達(dá)。。同時，使用“corrplot”軟件包進(jìn)一步分析和繪制了這 12 個 ARG 和 11 個 ERG 之間與預(yù)后相關(guān)的相關(guān)性。然后，選擇?；鶊D（P<0.05，|cor|>0.3）的基因?qū)?，其中正值表示正相關(guān)，負(fù)值表示負(fù)相關(guān)。

負(fù)相關(guān)的API和EPI構(gòu)建

為了進(jìn)一步研究ARG和ERG之間的串?dāng)_，根據(jù)PCA的12個預(yù)后相關(guān)ARG和11個預(yù)后相關(guān)ERG計(jì)算和量化每個腫瘤組織中的失巢凋亡和EMT水平，并分別定義API和EPI。COAD 患者的 API 和 EPI 之間存在負(fù)相關(guān)性。隨后，根據(jù)API和EPI評分，將COAD患者分為四個分子亞型組，即API高+EPI高；API 高 + EPI 低；API 低 + EPI 高；以及 API 低 + EPI 低。預(yù)后分析結(jié)果表明，與其他三組相比，API Low + EPI High 組患者的生存時間最短。然后，合并其他組COAD患者的數(shù)據(jù)，與API低+EPI高組進(jìn)行預(yù)后分析，得到相應(yīng)的p值<0.001。兩項(xiàng)分析結(jié)果均表明，高失巢凋亡抵抗和高 EMT 水平與不良預(yù)后相關(guān)。

“API低+EPI高”和“其他”組中DEG的富集分析

隨后，對API低+EPI高組的DEG進(jìn)行分析并與其他組進(jìn)行比較?；趞FC|的標(biāo)準(zhǔn)?> 1.8，篩選了70個DEG，并繪制了火山圖使用聚類熱圖。使用條形圖繪制的KEGG分析表明，兩組的DEGS主要富集在“粘著斑”、“病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用”、“ECM-受體相互作用”、“NF-κB信號通路、 ” “IL-17 信號通路”、“趨化因子信號通路”、“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”、“PI3K-Akt 信號通路”。通過弦圖繪制的 GO 分析表明，兩組在分子功能 (MF)、生物過程 (BP) 或細(xì)胞成分 (CC) 方面存在重大差異。DEGs主要富集在“膠原原纖維組織”、“細(xì)胞外基質(zhì)組織”、“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織”、“抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫應(yīng)答”、“外部封裝結(jié)構(gòu)組織”、“體液免疫應(yīng)答”、“抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫應(yīng)答”等方面。體液反應(yīng)”和“傷口愈合”。根據(jù)以下過濾標(biāo)準(zhǔn)，使用多個 GSEA 圖描述兩組之間的 GSEA 富集分析：FDR<0.25 和 NOM P<0.05。API低+EPI高組中富集的前五位功能是“哮喘”、“ECM-受體相互作用”、“糖胺聚糖生物合成”、“蛋白質(zhì)消化和吸收”和“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”。其他組中富集的五個主要功能被記錄為“抗壞血酸和交替代謝”、“脂肪酸降解”、“氮代謝”、“戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化”和“蛋白質(zhì)輸出”。

預(yù)后 ARG 和 ERG (PAEG) 風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建、PCA 分析以及臨床病理參數(shù)的生存分析

為了構(gòu)建基于失巢和EMT的COAD患者風(fēng)險(xiǎn)模型，將12個與預(yù)后相關(guān)的ARG和11個與預(yù)后相關(guān)的ERG結(jié)合起來，然后對23個基因進(jìn)行Lasso回歸分析。相應(yīng)的系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)通過1000倍交叉驗(yàn)證進(jìn)行評估。確定最優(yōu)懲罰參數(shù)lambda，并根據(jù)最小準(zhǔn)則計(jì)算相應(yīng)的系數(shù)準(zhǔn)則。最后，構(gòu)建了三mRNA（NAT1、PCOLCE2、CDKN2A）預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。使用以下公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評分：風(fēng)險(xiǎn)評分=（-0.135312062940216×NAT1表達(dá)）+（0.178733977096469×PCOLCE2表達(dá)）+（0.0267778987311829×CDKN2A表達(dá)）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分值將 COAD 患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組或低風(fēng)險(xiǎn)組。然后，GSE17536選擇數(shù)據(jù)集作為測試集進(jìn)行驗(yàn)證，而選擇TCGA數(shù)據(jù)集（n = 452）作為訓(xùn)練集。風(fēng)險(xiǎn)曲線、散點(diǎn)圖和風(fēng)險(xiǎn)熱圖用于突出 COAD 患者的生存時間、風(fēng)險(xiǎn)評分和三個基因豐度之間的關(guān)系，這些關(guān)系是使用訓(xùn)練確定的。預(yù)后分析的結(jié)果顯示，與訓(xùn)練中的低風(fēng)險(xiǎn)患者相比，高風(fēng)險(xiǎn)患者的生存期較短（p<0.001和測試集（p=0.006）。此外，ROC曲線用于表征風(fēng)險(xiǎn)模型的特異性和敏感性。對于 1 年、3 年和 5 年風(fēng)險(xiǎn)評分，訓(xùn)練集中的 ROC 曲線下面積 (AUC) 值分別為 0.658、0.684 和 0.680，而測試集的對應(yīng)值為 0.655、0.633 和 0.634。此外，還使用 Rtsne 包和 ggplot2 包繪制訓(xùn)練集中的 t-SNE 分析圖像和測試集，獨(dú)立。scatterplot3d 程序用于捕獲訓(xùn)練的 PCA 分析的 3D 圖像和測試集。上述發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了一個事實(shí)，即高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者在訓(xùn)練和測試集中表現(xiàn)出良好的異質(zhì)性。最后，根據(jù)COAD患者的臨床特征（如性別、分期、年齡和TNM分期）在訓(xùn)練集中對COAD患者進(jìn)行亞分類，并比較亞分類后高危和低?；颊叩纳鏁r間。KM曲線顯示，一些亞組如年齡（≤65歲和>65歲）、性別（男性和女性）、M0（無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者）、N0或N 1-2（有或沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），III-IV 期和 T 3-4顯示出顯著的生存期（P<0.05）

Cox 回歸分析和列線圖開發(fā)

在本研究中，進(jìn)行了單變量和多變量 Cox 回歸分析，以確定風(fēng)險(xiǎn)模型是否可以作為出色的獨(dú)立預(yù)后特征。單變量 Cox 回歸分析的結(jié)果表明，年齡、T 分期、M 分期、N 分期和風(fēng)險(xiǎn)評分等因素與訓(xùn)練集中的 OS 顯著呈正相關(guān)。此外，在測試集中，風(fēng)險(xiǎn)評分、等級和 OS 之間觀察到了很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。另一方面，對單變量分析中涉及的顯著因素進(jìn)行多變量回歸分析表明，訓(xùn)練集中的年齡、M分期、T分期和風(fēng)險(xiǎn)評分等特征與 OS 顯著相關(guān)，而測試集中的風(fēng)險(xiǎn)評分和等級與 OS 顯著正相關(guān)。上述研究結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型是一種有效且獨(dú)立的預(yù)測因子，優(yōu)于年齡和 TNM 分期等臨床因素。

此后，根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，本研究開發(fā)了列線圖，其中包括分期、年齡和風(fēng)險(xiǎn)評分等因素。此外，還繪制了列線圖的校準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明所有三個校準(zhǔn)曲線（1 年、3 年和 5 年）都接近標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而證明了可接受的預(yù)測效果。DCA 曲線表明列線圖比極端曲線更有利。ROC 曲線表明列線圖、年齡、風(fēng)險(xiǎn)和分期的 AUC 值分別為 0.792、0.662、0.606 和 0.730。與風(fēng)險(xiǎn)評分曲線、年齡曲線和分期曲線相比，列線圖曲線表現(xiàn)出更大的 AUC 值，表明列線圖是更好的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。

PAEG 風(fēng)險(xiǎn)模型的免疫浸潤分析、MCP 計(jì)數(shù)器和藥物敏感性

早期研究表明，TME 與 COAD 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、免疫治療反應(yīng)和藥物敏感性有關(guān) (?22?–?24?)。TME 中存在的基質(zhì)細(xì)胞的含量由基質(zhì)分?jǐn)?shù)表示。免疫評分表示TME中免疫細(xì)胞的含量。高風(fēng)險(xiǎn)患者表現(xiàn)出較高的基質(zhì)細(xì)胞水平，然而，低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組之間的免疫細(xì)胞比例沒有觀察到顯著差異。較高的腫瘤純度與更好的預(yù)后相關(guān)，因?yàn)樗砻髁私M織中存在的腫瘤細(xì)胞的比例。低風(fēng)險(xiǎn)組的腫瘤純度較高。TIDE 評分用于評估惡性樣本基因表達(dá)譜中腫瘤免疫浸潤的潛力，并可以預(yù)測對免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的反應(yīng)。高?；颊弑憩F(xiàn)出細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 (CTL) 排除、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 和 CTL 功能障礙的表達(dá)增強(qiáng)。然后利用ssGSEA技術(shù)研究16種免疫細(xì)胞的浸潤狀態(tài)，并得出13種免疫功能的評分，以進(jìn)一步評估免疫浸潤與風(fēng)險(xiǎn)模型之間的關(guān)系。低風(fēng)險(xiǎn)患者表現(xiàn)出較高的CD8?+?T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、B細(xì)胞、Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞浸潤，以及較高的APC_co_inhibition和Cytolytic_activity等免疫功能。另一方面，高危患者在訓(xùn)練集中表現(xiàn)出較高的巨噬細(xì)胞浸潤水平和Type_II_IFN_response等免疫功能。在測試集中，低風(fēng)險(xiǎn)組表現(xiàn)出較高的免疫功能，如檢查點(diǎn)、溶細(xì)胞活性、APC_co_inhibition、HLA、T_cell_co_inhibition、炎癥促進(jìn)和T_cell_co_stimulation。他們還顯示 aDC、B 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、TIL、iDC、Th2 細(xì)胞、Th1 細(xì)胞、CD8 +?T 細(xì)胞和 Treg 細(xì)胞的浸潤水平較高。然后采用MCPcounter軟件比較兩組10個免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的含量。高風(fēng)險(xiǎn)組含有較多數(shù)量的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，而低風(fēng)險(xiǎn)組含有更多的 B 譜系、細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和 NK 細(xì)胞。。此外，還評估了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中的10種常見免疫檢查點(diǎn)分子和24種主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異

最后，評估了高危和低?；颊邔OAD常用治療藥物的敏感性，結(jié)果表明，高?；颊邔魉麨I的敏感性較高，而低?；颊邔魉麨I的敏感性較高。對吉非替尼的敏感性。兩組對喜樹堿的敏感性沒有差異

PAEG 在細(xì)胞和組織實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)模型中的驗(yàn)證

本研究構(gòu)建了HCT-116和DLD-1等抗失巢凋亡COAD細(xì)胞系。然后采用qPCR的方法分別檢測親本組和失巢凋亡抗性組中NAT1、CDKN2A和PCOLCE2的mRNA表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在失巢凋亡抵抗組中，NAT1 mRNA 表達(dá)水平降低，而 CDKN2A 和 PCOLCE2 mRNA 表達(dá)水平升高，由此得出結(jié)論：NAT1 可以促進(jìn)失巢凋亡，而 CDKN2A 和 PCOLCE2 負(fù)責(zé)失巢凋亡。失巢凋亡抵抗。考慮到 PAEGs 在 COAD 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的重要作用, 分別選取 4 例無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移的原發(fā) COAD 組織, 檢測上述 3 個基因的蛋白表達(dá)水平免疫組化。一項(xiàng)早期研究表明，Claudin-1 可以通過上調(diào) ZEB-1 來減弱結(jié)直腸癌中 E-鈣粘蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn) EMT 并減少失巢凋亡 (?13）。N-鈣粘蛋白也是 EMT 的關(guān)鍵標(biāo)志物之一。因此，Claudin-1 和 N-鈣粘蛋白被用作參考并與三種 PAEG 進(jìn)行比較。結(jié)果提示,與肝、肺轉(zhuǎn)移組織相比,無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織中NAT1蛋白表達(dá)量升高,而肝、肺轉(zhuǎn)移組織中CDKN2A、PCOLCE2蛋白表達(dá)量升高。上述研究結(jié)果表明，高失巢凋亡抵抗、高 EMT 與 COAD 更遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間呈正相關(guān)。