Analytcial Chemistry|分子信標(biāo)分子內(nèi)加速組裝:基于DNA納米結(jié)構(gòu)的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物傳感空間限制策略

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末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)于1972年在小牛胸腺中被發(fā)現(xiàn)，它能夠催化核苷酸在帶有3 ' -羥基(OH)末端的寡核苷酸鏈上的不依賴模板的逐步添加。TdT在臨床醫(yī)學(xué)和血液病理學(xué)中的主要生理功能的興趣源于急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)、急性未分化白血病(AUL)和急性髓系白血病(AML)的一個(gè)亞群中出現(xiàn)高水平的酶活性。有研究者認(rèn)為T(mén)dT的診斷、預(yù)后、分型、隨訪和評(píng)估意義可作為上述疾病的重要診斷生物標(biāo)志物而被廣泛應(yīng)用。它允許研究人員研究DNA修復(fù)機(jī)制的效率和細(xì)胞的整體基因組穩(wěn)定性。因此，TdT活性的檢測(cè)不僅在癌癥生物學(xué)、分子診斷和血液疾病中至關(guān)重要，而且在理解細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、疾病機(jī)制和指導(dǎo)治療干預(yù)方面也至關(guān)重要。

到目前為止，TdT分析的常規(guī)方法主要是基于凝膠電泳和免疫分析法然而，它們受到放射性危害和復(fù)雜操作的限制，也受到抗體成本高和穩(wěn)定性差的限制。目前提出的生物傳感器放大器的反應(yīng)依賴于聚合后的DNA尾部與其他反應(yīng)物在本體溶液中的隨機(jī)碰撞和相互作用，這不僅導(dǎo)致了較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，而且降低了反應(yīng)效率。此外，還有一些研究利用無(wú)機(jī)納米顆粒作為反應(yīng)介質(zhì)來(lái)輔助反應(yīng)物和信號(hào)傳遞。納米顆粒的合成通常涉及耗時(shí)和勞動(dòng)密集型的過(guò)程來(lái)制備、純化和表征材料，降低了檢測(cè)的簡(jiǎn)單性和用戶的無(wú)友性。這些情況清楚地表明，目前檢測(cè)TdT活動(dòng)的技術(shù)仍然面臨重大挑戰(zhàn)。因此，對(duì)TdT檢測(cè)的替代策略的開(kāi)發(fā)是一個(gè)持續(xù)和不斷增長(zhǎng)的需求，它可以有效地克服隨機(jī)碰撞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和無(wú)機(jī)納米顆粒的使用相關(guān)的限制。

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近日，合肥工業(yè)大學(xué)徐建國(guó)副教授，安徽大學(xué)吳李君教授團(tuán)隊(duì)在Analytcial Chemistry期刊上發(fā)表了題為“Intramolecular Accelerated Assembly of Molecular Beacons: A DNA Nanoarchitecture-based Spatial Confinement Strategy toward Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Biosensing”的研究論文。

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c03103

該研究報(bào)道了一個(gè)目標(biāo)觸發(fā)的分子內(nèi)加速分子信標(biāo)(MB)組裝，用于快速和實(shí)時(shí)分析TdT活性。

3D DNA納米結(jié)構(gòu)首先是通過(guò)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)雜交鏈反應(yīng)(HCR)來(lái)設(shè)計(jì)的。用聚胸腺嘧啶(poly-T)環(huán)設(shè)計(jì)了若干mb，然后將其偶聯(lián)在支架DNA納米結(jié)構(gòu)上，使獲得的MB-DNA納米結(jié)構(gòu)在超級(jí)DNA納米結(jié)構(gòu)內(nèi)外含有大量的自由3 ' -羥基(OH)末端。此外，由于MB對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)的限制，不同MB之間的距離較近，MB的局部濃度顯著提高。一旦遇到目標(biāo)TdT, TdT可以立即識(shí)別自由?OH基團(tuán)，并催化腺嘌呤核苷酸的非模板結(jié)合，從而產(chǎn)生多個(gè)多聚a鏈，通過(guò)分子內(nèi)加速組裝過(guò)程與多個(gè)MBs快速反應(yīng)。因此，基于時(shí)間依賴性的MBs熒光的顯著增強(qiáng)可以應(yīng)用于TdT的穩(wěn)健分析。

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不同策略之間的對(duì)比。

信號(hào)增長(zhǎng)的行為解釋以及矯正曲線。

證明選擇性。

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回收性實(shí)驗(yàn)。

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綜上所述，提出了一種基于DNA納米結(jié)構(gòu)的生物傳感策略，該策略通過(guò)分子內(nèi)加速組裝分子信標(biāo)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)TdT的超靈敏和特異檢測(cè)。與傳統(tǒng)的利用自由MBs感知TdT的分子間識(shí)別模型相比，支架DNA納米結(jié)構(gòu)的空間限制效應(yīng)大大增加了目標(biāo)識(shí)別的活性?OH位點(diǎn)，縮短了活性MBs之間的距離。三重效應(yīng)導(dǎo)致多個(gè)長(zhǎng)尾聚a與MB的分子碰撞頻率顯著增加，最終實(shí)現(xiàn)了靶催化信號(hào)生成反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的顯著改善。即使在20分鐘內(nèi)，該方法被觀察到具有很高的靈敏度。此外，基于DNA納米結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法對(duì)從人血清中篩選TdT具有良好的生物穩(wěn)定性，為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的TdT酶提供了潛在的應(yīng)用前景。

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編輯：王本初

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