TA克隆連接接頭法是目前NGS文庫構(gòu)建流程中DNA文庫的主要方法之一。TA克隆連接接頭法主要包括以下流程。

DNA片段化的經(jīng)典方法之一是使用超聲設(shè)備對DNA進(jìn)行物理打斷。機(jī)械打斷DNA的方法均勻性好，但是對DNA樣本的損傷較大，且通量較低，儀器和耗材的成本也較高。

另一種打斷DNA的方法是使用片段化酶對DNA進(jìn)行均勻的打斷。這種打斷無需特殊設(shè)備，使用方法簡單且通量較高，是目前熱門的DNA片段化方式。

愛博泰克（ABclonal ) 提供DNA Frag Module（Cat.No.RK20260），這種片段化模塊可以通過控制反應(yīng)時(shí)間來達(dá)到不同的片段化效果。

圖1. Human Blood gDNA使用DNA Frag Module打斷不同時(shí)間后的文庫構(gòu)建片段大小

通過物理或酶切的方式將提取好的DNA片段化后，這些DNA片段仍不可以進(jìn)行接頭連接步驟，原因在于：打斷過程產(chǎn)生的DNA片段，有的是平末端，有些是粘性末端，且其末端不一定存在磷酸基團(tuán)或者羥基基團(tuán)。

平末端經(jīng)過加A步驟后就可以與帶有突出T的接頭進(jìn)行連接了，而粘性末端，還需要補(bǔ)齊后才可以進(jìn)行加A。

愛博泰克（ABclonal )可以提供末端修復(fù)和加A過程中所需要的一系列原料酶，例如Klenow片段化酶（Cat.No.RK20525）、Taq DNA聚合酶（Cat.No.RK20600）等。

圖2.末端修復(fù)與加A的流程

經(jīng)過片段化、末端修復(fù)與加A步驟后，DNA片段的結(jié)構(gòu)變成了3’端帶有A尾的結(jié)構(gòu)。以常見的Y型接頭示意，Y型接頭的互補(bǔ)3’端帶有突出的T，DNA片段與接頭在DNA連接酶的作用下，通過TA克隆方式完成連接。愛博泰克（ABclonal )可提供這一步的關(guān)鍵酶——T4 DNA連接酶（Cat.No.RK21500）。

圖3.常規(guī)Y型接頭示意圖

在完成接頭連接后，如果Y型接頭是帶有Index的完整型長接頭，且文庫產(chǎn)量滿足上機(jī)測序需求的情況下，可以不進(jìn)行文庫擴(kuò)增；如果使用的是不帶有Index的截短型接頭，還需要使用帶有Index序列的Primer對文庫進(jìn)行富集，才可以進(jìn)行后續(xù)的上機(jī)測序步驟。

愛博泰克（ABclonal )可以提供多種NGS場景使用的PCR Mix，歡迎咨詢、試用和購買。

圖4.全長型接頭與截短型接頭引入Index的方式

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公司簡介

愛博泰克生物科技有限公司（ABclonal Technology Co.,Ltd.）成立于2011年，作為生命科學(xué)解決方案的提供商，旨在為更多的科研工作者、IVD企業(yè)、新技術(shù)開發(fā)企業(yè)提供抗體、酶、NGS產(chǎn)品和蛋白制品等全套解決方案。